[发明专利]一组蛇毒来源的活性肽的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用化学方法制备N端为焦谷氨酸的肽类化合物，以及这类肽化合物在抗肿瘤领域的具体用途。

背景技术

蛇毒是由毒蛇的毒腺分泌的天然混合物，包括蛋白、多肽和酶类，具有抗凝、镇痛、促进神经生长和抑制肿瘤细胞生长等生物活性，是研究开发新药的重要天然化合物库之一。蛇毒中的抗肿瘤组分主要有解离素、细胞毒素和能诱导细胞凋亡的酶类及其他蛋白和多肽因子。CN101177452A公开了从断尾蝮蛇中制备具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移活性的解离素的方法；CN101270159A公开了一种抗肿瘤细胞毒素，分子量为6kDa；CN101429525A公开了表达抗肿瘤转移的蛇毒金属蛋白酶抑制剂的方法，该抑制剂分子量为46kDa；CN1781551A公开了一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制肿瘤细胞侵袭，其分子量约为100kDa。这类大分子蛋白在发挥其抗肿瘤活性的同时，也表现出了强免疫原性以及易被蛋白酶水解，半衰期短等缺点，故而制约了其临床应用。因此，有必要利用蛇资源，开发蛇毒中的小分子抗肿瘤药物。

Kai-Fa Hang等曾报道了在竹叶青蛇毒中发现了3个分子量在1000以下的具有抑制金属蛋白酶活性的小肽，参见：Kai-Fa Hang，Chin-Chun Hang，Shih-Hsiung Wu等，Characterization of Three Endogenous Peptide Inhibitors forMultiple Metalloproteinases with Fibrinogenolytic Activity from the Venom ofTaiwan Habu(Trimeresursu mucrosquamatus)，Biochemical And BiophysicalResearch Communications.1998，248：562-566。这三个具有抑制金属蛋白酶活性的小肽均为三肽，且其N末端均是焦谷氨酸。CN101058572A公布了从皖南尖吻蝮蛇中分离具有抑制肝肿瘤细胞增殖活性小肽的方法，其分子量为429，与上述Kai-Fa Hang等报道的三个多肽中的其中一个为同一物质。总体上目前对蛇毒中小分子活性肽，特别是3KDa以下的短肽的研究开发还远不及大分子蛋白深入。同时小分子活性多肽在粗毒中含量非常低，因而从少量粗毒样品中提取活性肽往往达不到研究用量，从大量粗毒原料中虽然能够获得足够量的活性肽，但是显然增加了研究和开发成本。鉴于小分子肽类化合物仅由几个到几十个氨基酸构成，序列较容易确定，因而利用多肽固相合成技术可以很容易制备大量活性肽，解决了从粗毒中提取量少的难题。但是某些蛇毒活性肽的N端常为焦谷氨酸，具体参见：梁宁生，蛇毒中的降压组分-血管紧张素转化酶抑制剂，中国《蛇志》杂质，1993，5(3)2-5。焦谷氨酸是谷氨酸通过环化后形成的，该步反应是在蛇毒的毒腺中通过焦谷氨酸化酶催化完成的，但是目前暂没有从蛇的毒腺中提取焦谷氨酸化酶或利用其它手段将多肽N端谷氨酸环化的报道。由于现有的固相合成技术通常只能够提供N端是谷氨酸的多肽，因而需要对N端谷氨酸进行环化处理，以达到预期的活性。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种制备N端为焦谷氨酸的寡肽的方法，该方法包括：

方法(一)：将N端为谷氨酸的寡肽样品溶解在pH值2～6的缓冲液中，加入催化量的CuCl₂，于60～95℃加热，将溶液冷冻干燥后即得相应的N端为焦谷氨酸的寡肽。或

方法(二)：将N端为谷氨酸的寡肽样品在固相下均匀加热，得到相应的N端为焦谷氨酸的寡肽。其中，均匀加热的方式例如：将样品在导热良好的金属板上铺成薄层然后加热，为达到此目的可以采取其他类似的加热手段，如微波加热、铺成薄层光照加热等。

上述方法中，其中寡肽是指氨基酸数目少于等于10的多肽，优选氨基酸数为3的寡肽。