[发明专利]一种黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法及其鉴别试剂盒

权利要求书

1.一种黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)白蛉DNA抽提；

(2)所提取DNA进行PCR扩增：扩增所用引物序列选自白蛉核糖体DNA第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)的高度保守区，引物的序列为：上游：5′-CCT GGT TAG TTT CTT TTCCTC CGC T-3′，SEQ ID NO：1，下游：5′-CGC AGC TAA CTG TGT GAAATC-3′，SEQID NO：2；PCR扩增产物进行纯化回收；

(3)回收的PCR产物进行酶切反应：所用限制性内切酶为Dra I；

(4)酶切后产物进行3.0％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切条带，判断白蛉种类情况，判断方法如下：经Dra I限制性内切酶后，中华白蛉由于没有该酶的酶切位点，仍然是原片段的大小，约为450bp大小；亚历山大白蛉有4个酶切位点，分别在66bp；76bp；203bp；357bp处，有5个酶切片断；吴氏白蛉有2个酶切片断，分别在80bp，391bp处，有3个酶切片断；长管白蛉有一个酶切位点，在353bp处，有2个酶切片断，在不完全酶切时，则有3个酶切片断。

2.根据权利要求1所述的黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法，其特征在于：步骤(1)所述的白蛉DNA抽提包括如下步骤：

(1)单只白蛉置于1.5ml研磨管中，加入65℃裂解液120μl，1.5μlRNAse A，研磨30秒，混匀，置于37℃水浴中60分钟，再加入20mg/mL的蛋白酶K 3μl，50℃水浴1小时至完全消化；

(2)加入苯酚、氯仿和异戊醇的混合液120-150μl，充分混匀，常温下14,000rpm离心10min；

(3)取上清，加入2-3倍体积95％或无水乙醇，常温下14,000rpm离心10min；

(4)弃上清，沉淀自然或37℃烘箱中烘干；

(5)加入Tris-EDTA缓冲液30-50μl溶解，-20℃保持备用。

3.根据权利要求2所述的黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法，其特征在于：所述的裂解液为DEB缓冲裂解液，该DEB缓冲裂解液含有0.5％SDS，25m mol/L EDTA，0.1mol/L pH为8.0的Tris-OH和0.2mol/L NaCl；所述的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液比例为苯酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1；所述的Tris-EDTA缓冲液含有10m mol/L Tris-Cl和1m mol/L EDTA，pH为8.0。

4.根据权利要求1所述的黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法，其特征在于：步骤(2)所述的引物浓度为：25-50μmol/L。

5.根据权利要求4所述的黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法，其特征在于：所述的引物浓度为：50μmol/L。

6.根据权利要求1所述的黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法，其特征在于：步骤(2)所述的PCR扩增为：将双蒸灭菌水10μl，2×Master PCR mix 12.5μl，50μmol/L的引物1μl，获取的DNA样本1.5μl，充分混匀后进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，35个循环后扩增，72℃延伸10min；所述2×Master PCR mix：含MgCl24mM；dNTPs 0.4mM；Taq DNA聚合酶0.05u/μl。