[发明专利]含TFPI基因与GFP基因双顺反子的逆转录病毒真核表达载体及构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及含人组织因子途径抑制因子(TFPI)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因双顺反子的逆转录病毒真核表达载体及构建方法及应用。

背景技术

血管再狭窄(restenosis，RS)是目前困扰心血管疾病治疗的难题之一，近年来干细胞技术与基因治疗技术的快速发展，给血管再狭窄防治带来了新的希望。TFPI为机体主要的抗凝血因子，是组织因子(tissue factor，TF)唯一的特异性抑制剂，属于Kunitz型蛋白酶抑制剂。其通过抑制FXa、TF/FVIIa复合物的功能参与机体凝血过程和血栓形成的调节。近年来大量研究表明，TFPI能有效抑制血管损伤后的血栓形成、炎症反应及平滑肌的增殖与迁移。其在预防RS方面的作用日益引起人们的关注。初步动物实验显示，静脉滴注TFPI重组蛋白对气囊损伤诱发的血管再狭窄具有明显的抑制作用。采用经导管给气囊损伤的血管局部灌注以脂质体为载体的TFPI基因，可使血管狭窄的程度明显减轻。将带有TFPI基因的重组腺病毒用于血管再狭窄动物模型的治疗，可使血管狭窄的程度减少43％。直接使用TFPI重组蛋白，由于其半衰期短，使用剂量大，给药时间长，价格昂贵等不足因素成为临床应用的瓶颈。因此基因治疗可能是更为有效的方法，但一般的病毒基因载体缺乏有效的靶向性，是限制其推广应用的主要因素之一。

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，因其具有高度自我更新能力及定向迁移分化为血管内皮细胞的潜能，是目前治疗缺血性血管疾病的理想种子细胞。同时EPCs在体外能稳定高效地表达外源基因，可以作为基因治疗的载体将治疗基因带到靶器官，是携带外源基因的良好载体。

血管再狭窄的主要防治策略是：1、抑制病变局部的血管平滑肌细胞增殖；2、抑制病变局部的炎症反应和血栓形成；3、促进病变局部的血管内皮快速愈合。因此我们设想，采用具有抑制血栓形成、炎症反应和血管平滑肌细胞增生的TFPI基因转化具有向受损内皮部位定向聚集且能分化为血管内皮细胞的EPCs，从而形成一种集抑制血栓形成、炎症反应和血管平滑肌细胞增生及促进受损血管内皮愈合于一体并能靶向血管受损组织的新型治疗技术，可明显改善血管再狭窄的防治效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种含TFPI基因与GFP基因双顺反子的逆转录病毒真核表达载体。

本发明的第二个目的是提供一种可同时表达TFPI和GFP两种蛋白的大鼠内皮祖细胞。

本发明的第三个目的是提供一种含TFPI基因与GFP基因双顺反子的逆转录病毒真核表达载体的构建方法。

本发明的第四个目的是提供可同时表达TFPI和GFP两种蛋白的大鼠内皮祖细胞的构建方法。

本发明为进一步开展将TFPI基因修饰的内皮祖细胞应用于血管再狭窄防治研究并使之为今后用于临床疾病防治提供有效工具。

本发明的技术方案概述如下：

含人组织因子途径抑制因子基因与绿色荧光蛋白基因双顺反子的逆转录病毒真核表达载体，用下述方法制成：以序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述序列为PCR引物，pIRES-TFPI为模板，扩增出以序列表SEQ ID NO.1所示的人类组织因子途径抑制因子基因的全长cDNA，将其插入到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中，获得pMSCV-TFPI-IRES-GFP重组质粒。采用DNA测序方法进行鉴定。

可同时表达TFPI和GFP两种蛋白的大鼠内皮祖细胞，是用下述方法构建，以序列表SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所述序列为PCR引物，pIRES-TFPI为模板，扩增出以序列表SEQ ID NO.1所示的人类组织因子途径抑制因子基因的全长cDNA，将其插入到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中，获得pMSCV-TFPI-IRES-GFP重组质粒；将所述pMSCV-TFPI-IRES-GFP重组质粒用磷酸钙法转染293T细胞，在293T细胞中进行病毒的包装，收集含有病毒的细胞上清液，感染大鼠骨髓来源的内皮祖细胞，获得可同时表达TFPI和GFP两种蛋白的大鼠内皮祖细胞。ELISA法检测EPCs培养上清中TFPI蛋白的表达，RT-PCR检测EPCs内TFPI mRNA的表达。