[发明专利]重组含有外源vgb的糖多孢红霉菌株的方法

权利要求书

1.重组含有外源vgb的糖多孢红霉菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1).糖多孢红霉菌的电穿孔转化：首先，将糖多孢红霉菌接种到10ml ABB1培养基中34℃，250rpm摇瓶培养，细菌培养液用超声波仪破碎细胞，12000rpm，4℃离心10min，用预冷的电穿孔洗液(0.3M甘露醇和3mM HEPES pH7.0)洗涤2次，悬浮于预冷的电穿孔缓冲液[含25％(w/v)PEG-3350的电穿孔洗液]中(按0.6-0.8ml/10ml菌液计算)，置于冰上。电穿孔转化试验操作按下面的步骤进行：取0.2ml上述已制备好的糖多孢红霉菌置预冷的微量无菌离心管中，与电击池一起放在冰上冷却。向微量离心管中加入100-200ng待转化的pBlueV，置于冰上30-60s，包括所有阳性和阴性对照。调节电穿孔仪，至电容为25μF、电压1.5kv、电阻100Ω。将菌体与待转化DNA充分混匀后加入预冷的2cm间隙的电击池中，轻击液体以确保菌体与DNA悬液位于电击池底部。将电击池放入电穿孔仪中，启动对细胞的电脉冲。脉冲结束后迅速取出电击池，室温28℃下孵育40-60min。加入0.8ml液体培养基ABB1，混匀后移至3.0ml的ABB1软琼脂糖上[aBB1软琼脂糖是0.6％(w/v)VII型低熔点琼脂糖，用于覆盖平板，此试验中事先加入未进行电穿孔转化的糖多孢红霉菌]。再接种于ABB13平板培养基上培养22-24h。再覆盖一层3.0ml的ABB1软琼脂糖，琼脂糖中加入适量的抗生素，观察转化子的生长状况。

(2).重组菌株的筛选与鉴定：将转化的糖多孢红霉菌接种于R5平板培养基中培养，温度为34℃。待菌株长满整个平板，铺上一层含有底物X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)的液体琼脂，GUS在含有X-gluc的培养基中能使宿主的菌落形成蓝色，通过此特点筛选含vgb的阳性克隆，即转化后的重组菌株。经提取质粒pBlueV和Kpn I和BstX I双酶切，通过电泳鉴定分子量来确定重组菌株。

(3).Southern blotting分析：用限制性内切酶消化基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。将凝胶移至一个玻璃干烤皿内，切下凝胶左上角做标记。将凝胶置于1.5mol/LNaCl，0.5mol/L NaoH中浸泡45min，轻轻连续振摇，使DNA变性。去离子水漂洗，浸泡于1mol/LTris-HCl(pH7.4)，1.5mol/L NaCl中，室温将凝胶继续浸泡15min。准备尼龙膜：用解剖刀片切去膜的一角。将凝胶漂浮于去离子水液面上，由下而上完全湿润，浸入转移缓冲液(10×SSC)中5min。将凝胶放入一个平皿内，倒入转移缓冲液。放上Whatman 3MM滤纸，湿透后赶出气泡。在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，并使两者的切角相重叠，用2×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，放置在膜的上方。切一叠(5～8cm高)略小于3MM滤纸的纸巾，放在滤纸上方，然后在纸巾上方放一块玻璃板，用一重物压实。上述DNA转移持续进行8-24h，每当纸巾浸湿后更换新的纸巾。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，并在膜上标记凝胶加样孔的位置。依次洗膜，先以6×SSC溶液于室温浸泡膜5min。从6×SSC溶液中取出膜，置室温晾干30min以上。将干燥的膜放至两张3MM滤纸之间，在烘箱内80℃烘0.5～2h。将含有目的DNA的膜漂浮于6×SSC液面上，浸入液体内泡2min。装入杂交盒中，盒中预先按每平方厘米尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液(6×SSC，5×Denhardt试剂，0.5％SDS，100μg/ml经变性断裂成片段的鲑精DNA，50％甲酰胺)，42℃水浴中温育1h。取膜放入另一杂交盒中，加入预杂交液(6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml经变性断裂成片段的鲑精DNA，50％甲酰胺)，再加入含25ng/ml ³²P标记的单链探针，42℃水浴振荡过夜。将膜放到2×SSC和0.5％SDS的托盘内，室温下浸泡5min。再将膜转移至另一盛有2×SSC和0.1％SDS的托盘中，室温温育15min，间或温和地摇动，然后将膜转移至另一盛有0.1×SSC和0.5％SDS的盒中，37℃温育30～60min，将溶液换为新配制的0.1×SSC和0.5％SDS，并将盒移至68℃水温中温育。用0.1×SSC于室温洗膜，再将膜置于一叠纸巾上，除去大部分液体。将膜用保鲜膜包好，尼龙膜DNA面向着曝光方向，获得放射自显影影像。

(4).载体在染色体上整合位点的确定：红霉素合成基因在染色体上成簇存在，为了不破坏红霉素合成基因，影响红霉素合成，选择与红霉素合成基因不相关的位点发生同源重组。经提取原始菌株和重组菌株基因组DNA，Mst I和Bgl I双酶切，以扩增的片段1为探针，进行Southern blotting分析。这两个酶切位点分别位于片段1和2中，未转化之前糖多孢红霉菌基因组DNA经这两种酶消化，以片段1为探针进行Southern blotting时可在321bp大小位置上显阳性，当与染色体基因组同源重组后vgb、启动子PmerR和GUS基因进入染色体，该DNA片段增加到3088bp，在约3.1kb大小处显阳性，确定了其整合位点。结果证明外源DNA已整合到宿主染色体DNA上，在传代培养过程中并未见有丢失现象。

(5).vgb在重组菌株中表达对代谢产物产率的影响

①重组糖多孢红霉菌的补料培养：发酵分三级进行：一级种子在35ml S2培养基中摇瓶培养。48h后转至3.5L S3培养基中进行二级种子培养，40h后将1.5L二级种子转至20L内有10L浓度减半S4培养基的中试发酵罐中，培养温度为34℃，pH＜7.1，搅拌转速初始值为700r/min，当DOT低于45％的空气饱和度时提高搅拌转速到900r/min；空气流量在前12h为0.35vvm，然后上调到0.85vvm，开始补料后再下调为0.7vvm；反应器上方空间压力控制在0.01MPa。发酵过程中要进行补料，在12-160h按2.4ml(L·d)的速率补加正丙醇；25h至发酵结束按4.8ml(L·d)速率补加豆油；30-90h按48ml(L·d)速率补加15％糊精。低流速时通过补料泵每分钟适量补料，高流速时可连续补料。

②重组糖多孢红霉菌红霉素效价的测定红霉素效价采用管碟法测定，以商品化的红霉素为标准品。具体操作方法如下：将35ml培养基[27.5g/L TSB，2g/L葡萄糖，2％(w/v)琼脂]置于培养皿(12×12cm)中，待凝固后，取35μl藤黄微球菌过夜培养物(30℃于LB培养基中培养18h)，倒入其中。糖多孢红霉菌重组菌株的发酵液通过装有0.2μm孔径滤膜的过滤器过滤，取过滤后的上清液10μl(或在甲醇中适当稀释)。在培养基表面放置四个小钢管[不锈钢制成，内径为(6.0±0.1)mm，外径为(8.0±0.1)mm，高为(10±0.1)mm的圆形钢管]，向培养基中对角的两个小钢管中分别滴加高浓度及低浓度标准溶液，另两个对角的小钢管中分别滴加高低两种浓度的供试品溶液。高低浓度的剂距为2∶1或4∶1。在30℃培养48h，测量各抑菌圈直径，作标准曲线并计算红霉素的浓度(g/l)。根据供试品效价按下面公式计算：供试品效价＝θ×标准品效价。

③重组糖多孢红霉菌发酵过程中红霉素的效价比较：结果比较了三批糖多孢红霉菌的原始菌株和三批重组菌株发酵产生红霉素的平均效价曲线。最终红霉素效价分别为3.98和5.15g/L，相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29％。计算48-144h之间的红霉素产率，重组菌株为36.5mg/(L·h)，原始菌株为24.3mg/(L·h)。重组菌株的红霉素比产率高出原始菌株约1倍。