[发明专利]动物饲料中4种细菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法

说明书

技术领域

本发明属于进出境动物饲料中4种细菌的指纹分析方法。 

背景技术

随着我国对外贸易的扩大，动物饲料的进口量也与日俱增。目前，我国进口的动物饲料包括白鱼粉、红鱼粉、牛肉骨粉、牛羊肉骨粉、鱼饲料等。沙门氏菌和志贺氏菌为当前进出境动物饲料的法检项目，而其他食品上的法检项目并未被列入其中，如阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙雷菌等。随着动物福利的日益提高，这些菌在将来也许会成为法检项目。 

基于DNA的检测方法已越来越多的被当前检验检疫行业标准所采纳，成为对大宗货物进行筛查的方法之一。细菌的16s rDNA是非常保守的一段序列，通过对其序列的分析，可将细菌鉴定到属，甚至是种。同时，对其序列的分析发现，各个细菌的16s rDNA具有限制性片段多态性。基于细菌16s rDNA的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)可以建立各种细菌的指纹图谱，因此可以通过对动物饲料中的细菌进行16s rDNA的PCR-RFLP分析，与所建立的指纹图谱进行比对，即可得出是哪种细菌，从而进行鉴别。 

该方法操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好等优点。目前国内外还没有建立针对动物饲料中的细菌16s rDNA的PCR-RFLP指纹图谱，本发明可弥补目前方法的缺陷。 

发明内容

本发明主要是应用14种内切酶对动物饲料中的4种细菌16s rDNA进行切割，从而16s rDNA的指纹图谱。 

本发明的主要原理为：针对4种细菌的16s rDNA，利用通用引物27f和1492r进行扩增，扩增产物用17种内切酶分别进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，显示出各个芽孢杆菌的特异性指纹谱图。 

本发明涉及过程如下： 

(1)常规方法分离鉴定动物饲料中常见的4种细菌。 

(2)细菌总DNA的提取 

利用细菌DNA提取试剂盒，分别提取4种菌的总DNA，步骤按照试剂盒操作说明。 

(3)PCR 

利用细菌16s rDNA通用引物对提取的细菌DNA进行16s rDNA扩增。 

(4)RFLP 

用14种内切酶对PCR产物进行切割。14种内切酶及其排布顺序如下： 

AvaI，BamHI，BgII，DraI，EcoRI，EcoRII，HindIII，Hinf，HpaI，PstI，SmaI，TaqI，XbaI，XmaI。 

(5)琼脂糖凝胶电泳 

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳胶为2％的琼脂糖凝胶。 

(6)PCR-RFLP指纹图谱的建立 

具体实施方式

对所得图谱进行分析，显示各个菌的谱图能相互区分，表明各个菌的指纹图谱具有特异性，可作为其他菌株PCR-RFLP比对的基础。 

图1是从饲料中分离的一种细菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 

图2是从饲料中分离的另外一种细菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 

图3是阪崎肠杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 

图4是戴氏西地西菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 

图5是金黄色葡萄球菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 

图6是居泉沙雷菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱。 

经比对，所分离的2种菌与其中的戴氏西地西菌和居泉沙雷菌完全吻合，因此鉴定为戴氏西地西菌和居泉沙雷菌。