[发明专利]一种家蚕生物反应器制备人白介素28A的方法及其制药用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用家蚕生物反应器制备人白介素28A的方法及其制药用途。

背景技术

人白细胞介素(interleukin)28A(hIL-28A)是一种新型的干扰素λ(IFN-λ)，与I类干扰素(IFN)的功能类似，具有抗病毒、抗增殖及免疫调节等活性。人自然白介素是通过分别刺激淋巴母细胞和人体白细胞，然后提纯制备而得。目前市场供应的只有由类淋巴母细胞产生的干扰素，是天然的多亚型的混合物。临床用的主要是重组制剂，剂型主要有粉剂和水剂，无口服剂型，使用均为注射给药。

家蚕杆状病毒表达载体系统(Bombyx mori baculovirus expressionvector system)是真核表达系统，已有许多基因在该系统中成功表达。用该系统在家蚕中表达外源基因，表达水平高、产物生物活性好。

目前，未见利用家蚕杆状病毒表达载体系统表达人白细胞介素(interleukin)28A的报道，以及关于人白细胞介素(interleukin)28A口服制剂的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种利用家蚕生物反应器制备人白介素28A的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用家蚕生物反应器制备人白介素28A的方法，通过基因工程方法获得重组的带有人白介素28A(hIL-28A)基因的家蚕Bombyx mori杆状病毒，并用该病毒接种家蚕幼虫或蛹，使人白介素28A在家蚕幼虫或蛹中获得高效表达。将高效表达人白介素28A的幼虫或蚕蛹制备成口服制剂，经动物试验表明具有显著的抗肿瘤作用。

上述技术方案中，所述重组的带有人白介素28A(hIL-28A)基因的家蚕Bombyx mori重组杆状病毒的制备方法为：

(1)根据GenBank已公开的hIL-28A的cDNA序列(GenBank登录号：BC113583)，合成hIL-28A基因的编码序列，克隆进T-载体，获pUC-hIL-28A质粒；

(2)用BamH I/EcoR I双酶切消化pUC-hIL-28A质粒回收hIL-28A基因片段，用BamH I/EcoR I双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual回收pFastBac-Dual片段，将hIL-28A基因片段插入到pFastBac-Dual的BamH I和EcoR I之间，将hIL-28A克隆进pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-Dual-hIL-28A重组质粒；

其中，质粒pFastBac-Dual是美国Invitrogen公司的产品，其产品名为PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR；pFastBac-Dual载体属于Bac-to-Bac(Bacteria to Baculovirus)表达系统，

(3)将pFastBac-Dual-hIL-28A重组质粒转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞，涂布于含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、X-gal的LB琼脂培养平板上，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid基因组Bacmid-hIL-28A DNA；

(4)将Bacmid-hIL-28A DNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取上清，获得重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A。

上述技术方案中，采用所述家蚕Bombyx mori重组杆状病毒接种家蚕幼虫或蛹的方法为：将重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-hIL-28A接种至五龄家蚕幼虫或蛹。进一步地，取5天后家蚕或蛹的血淋巴，分析检测hIL-28A表达水平，结果显示每毫升血淋巴中重组hIL-28A的量达33μg。

本发明的另一目的为提供一种含有人白介素28A药物的制备方法，为实现该目的，采用的技术方案为，一种含有人白介素28A药物的制备方法，采用上述技术方案获得的感染重组家蚕杆状病毒的家蚕幼虫或蛹经冷冻干燥后制成口服药物制剂；经动物试验表明具有显著的抗肿瘤作用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：