[发明专利]利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株

权利要求书

1.利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，其特征在于：以色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)CCGMC 4.331为出发菌株，将其单孢子菌悬液依次进行“紫外线和氯化锂复合诱变→大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变”，最后得到一株高产磷脂酶D的色褐链霉菌，用于发酵制备磷脂酶D。

2.根据权利要求1所述的利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，其特征在于：

步骤1

将出发菌株CCGMC 4.331进行紫外线和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：

(1)制备单孢子菌悬液

将色褐链霉菌CCGMC 4.331接种到马铃薯葡萄糖斜面培养基上，25～35℃恒温培养5～10天，待孢子成熟后，加入3～10mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的试管中，充分振荡，使孢子充分打散，成为单孢子菌悬液，用无菌生理盐水稀释调整菌个数达到10⁷～10⁹个/mL左右；

(2)诱变过程

在黑暗条件下进行紫外诱变，紫外灯功率15W，在照射之前，开启紫外灯预热20～30min，取4～7mL制备好的菌悬液于直径为9cm的无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器上、紫外灯下30cm处，开启培养皿盖在搅拌下进行照射，使处理均匀，操作时紫外诱变器用黑布包住，避免白炽光，诱变处理时间为15～120s，诱变结束后用报纸包严，为防止诱变后光复活，将诱变后的菌悬液避光放置0.5～3h，然后用10倍稀释法把经过照射的菌悬液用无菌生理盐水稀释，将对照组稀释涂于马铃薯葡萄糖平板培养基上，同时将诱变组稀释涂于含0.3％～0.5％氯化锂马铃薯葡萄糖平板培养基上，然后将平板诱变菌置于25～35℃恒温培养箱避光培养，培养时间7～10天；

(3)突变株的筛选

挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，25～35℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛；然后再选取5株磷脂酶D酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为磷脂酶D酶活大小；

步骤2

将经过紫外线和氯化锂复合诱变的高产磷脂酶D的菌株再进行大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：

(1)制备单孢子菌悬液

将经过紫外线和氯化锂复合诱变产生的一株稳定高产磷脂酶D的突变菌株接至PAD斜面培养基上，25～35℃恒温培养5～10天，待孢子成熟后，加入3～10mL 0.9％无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡，使孢子充分打散，再经纱布过滤即可得到单孢子菌悬液，用无菌生理盐水稀释调整至菌个数达到10⁷～10⁹个/mL左右；

(2)诱变过程

采用介质阻挡放电实验装置，等离子体产生于两个不同直径的圆形放电电极之间，取0.4～0.7mL制备好的单孢子菌悬液于直径60mm的石英玻璃平板上，然后将其放到下电极上，调整上电极到菌液液面的距离约为3～4mm，打开等离子体电源，诱变处理时间为10～90s，将处理后菌液稀释涂平板，培养基中添加0.3％～0.5％的氯化锂作为助诱变剂，对照菌直接稀释涂于马铃薯葡萄糖平板培养基中，每样做三个平行，25～35℃避光培养3～10天后统计菌落总数，取平均值计算诱变致死率，选择诱变时间，对菌种进行诱变处理；

(3)突变株的筛选

挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，25～35℃培养24h后，分别再接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛；然后再选取4株磷脂酶D酶活相对较高的突变株，对其进行摇瓶复筛，复筛每组做三个平行，过程同摇瓶初筛，其筛选依据为磷脂酶D酶活大小。

3.根据权利要求1或2所述的利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株，其特征在于：所用的马铃薯葡萄糖斜面培养基为：去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮沸30min，然后用纱布过滤，再按比例加入20g葡萄糖及1.5％～2.0％琼脂，再定容至1L，pH自然；诱变用马铃薯葡萄糖斜面培养基为上述马铃薯葡萄糖培养基基础上加入0.3％～0.5％的氯化锂；25～35℃恒温培养7～10天。