[发明专利]一种棘胸蛙微卫星DNA标记Ⅱ及其用途

说明书

本发明是申请日为2008.10.23、申请号为200810121952.3的《一种棘胸蛙微卫星DNA 标记及其用途》的分案申请。

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种棘胸蛙的DNA分子遗传标记及其用途。

背景技术

微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次 而组成的一段DNA。由于微卫星侧翼序列相对保守，根据其侧翼序列设计引物，可用PCR 扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星 序列的长度呈现多态性。微卫星序列广泛存在于真核生物基因组中，而且随机分布，具有 高度多态性，选择上中性，共显性等特点，是十分有效的遗传标记，被广泛应用于遗传图 谱构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲 缘关系(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15：137-142)、用微卫星DNA标记 进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”(公开号CN 1370834A)、用微卫星DNA标记进行家蚕分子连锁遗传分析的专利申请“家蚕的SSR标 记及其应用”(公开号CN 1970792A)。

棘胸蛙(Paa spinosa David)，属两栖纲、无尾目、蛙科。棘胸蛙个体大，肉质细嫩洁 白，味道鲜美，具有很高的营养价值和药用价值，素有“百蛙之王”的美称。由于人为捕 杀和自然环境的恶化，野生棘胸蛙资源遭到严重破坏，开展棘胸蛙人工养殖既有助于保护 野生资源，又能满足市场需求。现在，棘胸蛙是我国重要的养殖蛙类之一，但是由于其基 础研究薄弱，要实现规模养殖还有许多亟待解决的问题，其中包括需要一套有效的分子标 记对其进行遗传关系分析、种质资源调查、标记辅助育种等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记II，利用这些分子标记 能对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记II，该微卫星DNA标 记II的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，该微卫星编号为Psp19。

作为本发明的棘胸蛙微卫星DNA标记II的改进：棘胸蛙微卫星DNA标记II引物为下列 引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，

Psp 19    正向：TCACAATCGACGTAATGG

          反向：ACACACAGAGGGTCACACT。

本发明还同时提供了棘胸蛙微卫星DNA标记II的用途，其特征是：用于对棘胸蛙进行 遗传分析、种质资源调查或辅助育种。

实现上述发明的技术方案包括棘胸蛙(CA)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列 的阳性克隆的筛选及测序，确定了8个多态性丰富的微卫星标记Psp16、Psp17、Psp18、 Psp19、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。

本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立棘胸蛙的微卫星DNA的技术体系并利用这 些分子标记进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。因此，本发明提供了8个棘胸蛙微 卫星位点的DNA序列及扩增上述8个棘胸蛙微卫星位点的引物序列和扩增方法，8个棘 胸蛙微卫星位点用于棘胸蛙种质资源研究，遗传关系分析，标记辅助选种和标记辅助育种， 重复性好，多态性高，是一种可靠有效的分子标记。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明涉及的13个棘胸蛙自然种群的structure聚类图(K＝3)。

具体实施方式

实施例1、棘胸蛙(CA)_n微卫星富集文库的构建

依次进行以下步骤：

1)、用经典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(广西龙胜)基因组DNA。用限制性内切酶 Sau3AI酶切棘胸蛙基因组DNA，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下 300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒纯化回收酶切产物。