[发明专利]一种重组恶臭假单胞菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组恶臭假单胞菌及其构建方法和应用，利用该重组恶臭假单胞菌可以去除生活污水中的磷。

背景技术

无机磷酸盐通常被认为是湖泊富营养化的关键因子。因而，降低水环境中磷的浓度是控制富营养化的重要手段之一。

环境中磷的去除有物理、化学以及生物法。生物尤其是微生物，去除磷的机理在于包括Escherichia coli，Pseudomonas spp.等细菌均具有积累无机磷酸盐，生成多聚磷酸盐(poly-phosphate)的能力。但是，在天然条件下，微生物聚磷能力通常比较弱，或者需要厌氧好氧交替环境才能有效聚磷。

多聚磷酸盐由聚磷激酶(Poly-phosphate Kinase，PPK)催化形成。是由3～1000多个不等的正磷酸盐通过高能磷酸键连接而成的线性多聚体。聚磷通常被认为是能量储存的一种手段，同时具有多种生理功能。有学者通过转基因手段，将聚磷酸激酶基因ppk转化到各种质粒中，过量表达聚磷激酶。携带重组有ppk基因质粒的微生物或植物能够过量的吸收环境中磷酸盐形成大量聚磷。从而用于废水中磷的去除或者利用聚磷的络合能力降低环境中重金属毒性，增加重金属的生物有效性，增加植物对重金属的耐受性，提高植物对重金属的去除能力等。通过重组质粒表达ppk基因，虽然能够过量的表达聚磷激酶，但是，质粒表达的缺点同样明显，重组质粒容易丢失。只有在抗生素胁迫下才能够相对稳定存在，由此引发实际应用成本的增加。并且高拷贝质粒对菌的生命活动造成负担。因而质粒作为载体表达ppk基因有很大的局限。另外，当前用于废水中去除磷的研究中所用表达宿主全部为E.coli。E.coli直接用于废水或自然水体磷的去除是不切实际的。

整合表达一定程度上解决了质粒表达的遗传不稳定的问题，同时选择环境中以及废水处理的活性污泥中的优势种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)作为宿主，可以用于实际的废水处理。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有较高遗传稳定性的重组恶臭假单胞菌，能够高效去除废水中的磷。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组恶臭假单胞菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组恶臭假单胞菌在废水除磷中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种重组恶臭假单胞菌，它是DNA整合表达聚磷激酶ppk基因的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

上述重组恶臭假单胞菌的构建方法，它包括ppk基因的获取、载体的构建、三亲接合三大步骤，具体步骤如下：

(1)ppk基因的获取：

(1a)提取E.coli DH5α总DNA，具体方法参见《环境微生物实验技术》(北京：中国环境科学出版社，2004.71-72)。

(1b)根据大肠杆菌的基因序列(Genbank登录号：L03719)设计引物，并在引物5’端加入EcoR V酶切位点，以总DNA为模板，PCR扩增ppk基因。

(2)载体的构建：

(2a)将步骤(1b)得到的PCR产物插入到质粒pBBR1MCS-2中，获得重组质粒pBBR1MCS-2-ppk；具体为将质粒pBBR1MCS-2以及步骤(1b)得到的PCR产物经EcoRV酶切，质粒pBBR1MCS-2进行去磷酸化反应，PCR产物经磷酸化反应，在5’端加磷，然后将上述处理的PCR产物和质粒酶连反应过夜，即获得重组质粒pBBR1MCS-2-ppk。

(2b)将步骤(2a)得到的重组质粒pBBR1MCS-2-ppk转化E.coli DH5α进行复制。

(2c)提取重组质粒pBBR1MCS-2-ppk，作为模板，设计含有NoT I酶切位点的引物，PCR扩增含有多克隆位点上游多重启动子序列和多克隆位点下游终止子序列的片段；

(2d)将步骤(2c)得到的PCR产物经Not I酶切后插入到自杀质粒pUTmini-Tn5中，得到重组质粒pUTmini-Tn5-ppk。

(3)三亲接合：

(3a)将步骤(2d)得到的重组质粒pUTmini-Tn5-ppk经电击转化到供体菌E.coliSM10(λpir)(电击转化及感受态细胞的制备参见《分子克隆指南》【3^rd，北京：科学出版社.2002.】)。