[发明专利]一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测人类免疫缺陷病毒(HIV)经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。

二、背景技术

对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr.Kary B.Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr.Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。

2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了LAMP技术的实际应用。

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(AIDS：获得性免疫缺陷综合征)。目前针对HIV病毒缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。

三、发明内容

本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测HIV病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、成本低廉、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的HIV病毒检测。

本发明试剂盒包括两部分：

1.标记有可以识别HIV病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；

2.可以扩增待检测样品中的HIV病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的HIV病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

该试剂盒的工作原理为：

1.纳米金颗粒标记有能识别HIV特定序列的分子探针，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。

2.待检测样品中的HIV病毒DNA分子或HIV病毒RNA经环介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，HIV病毒的目标片段被放大10⁹倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。

3.混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，HIV病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别HIV病毒特定序列的分子探针杂交。

4.纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体(如附图所示)，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有HIV病毒DNA或RNA。

四、附图说明

标记有分子探针的纳米金颗粒与HIV病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA杂交示意图，纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体。

五、具体实施方式

本发明试剂盒包括2管溶液，一管中是标记有可以识别HIV病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒溶液50μl，一管中是250μl可以扩增待检测样品中的HIV病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的HIV病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

纳米金颗粒溶液中含有直径为20nm的纳米金颗粒，浓度为1.2nM，纳米金颗粒表面标记有巯基修饰的DNA探针。