[发明专利]一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于Vero细胞微载体培养的无血清培养基，更具体地说是用于Vero细胞微载体固定化培养的无动物来源成分无血清培养基，属于细胞工程技术领域。

背景技术

Vero细胞(African green kidney cell，Vero cell)是世界卫生组织和我国生物制品规程赞同的疫苗生产细胞系，是现阶段病毒疫苗生产的最主要细胞基质。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其它一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。

Vero细胞的贴附依赖生长特性，决定了其需要在适宜的介质表面贴附、铺展为前提的贴壁培养(anchorage-dependent culture)模式。Vero细胞贴壁培养的最经典和简便方法是以组织培养瓶(T-flask)和转瓶(roller bottle)的内表面为介质贴附生长。这些培养体系所能提供的细胞生长面积有限，细胞培养规模的放大只能依赖培养单元的增加，由此给疫苗生产带来诸如污染风险大、生产效率低、产品质量可控性差以及人力资源需求大等弊端。微载体培养(microcarrier culture)是融合悬浮培养优点的一种特化的细胞贴壁培养模式。其基本特征是细胞贴附于微载体表面并随其共同悬浮于培养基中生长。微载体的应用不仅大大增加了单位培养体积中细胞赖以生长的表面积，同时也加大了细胞培养过程监测和控制以及细胞培养规模放大的可实施程度。

疫苗的接种对象主要是针对大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组份复杂而尚不完全明确的混合物，其中，至少含有1000种不同蛋白质，总蛋白量高达60-150g/L。它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受Vero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的Vero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度的考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度；从病毒疫苗的安全性考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎(bovine spongiform encephalopathy)的朊病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。

由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括Vero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。美国、欧盟和日本等发达国家将于2010年全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。

培养基是影响体外培养细胞的形态、生长、代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。由于Vero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态，适用于Vero细胞微载体培养的无血清培养基应能有效地支持细胞在微载体表面的贴附、铺展。由此，不仅提高了Vero细胞无血清培养基配方成分的复杂程度，也加大了Vero细胞无血清培养基的成本控制压力。

文献报道的Vero细胞无血清培养基包含牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、动物明胶(胶原)等动物来源的添加成分。含BSA、动物明胶(胶原)等动物来源添加成分的无血清培养基在很大程度上遗留着动物来源血清在动物细胞培养的应用中可能产生的上述问题。

尽管国外已有多种商品化的Vero细胞无血清培养基上市，如美国Invitrogen公司的VP-SFM和OptiPro SFM、AXCELL Biotechnologies公司的MDSS2、JRH公司的EX-CELL^TMVERO等。但商品化的Vero细胞无血清培养基不同程度存在诸如培养基大多以液体的形式提供、价格昂贵、培养基的成分配方秘而不宣、细胞由含血清培养基转入无血清培养基培养存在适应过程等问题。

发明内容