[发明专利]一种编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其编码酶基因与应用。

背景技术

从结构简单的病毒到结构复杂的人类，各种各样的蛋白酶抑制剂发挥着巨大的作用。根据其蛋白结构及氨基酸序列的相似性，蛋白酶抑制剂一般被分为四种：天冬氨酸类蛋白酶抑制剂、半胱氨酸类蛋白酶抑制剂、非金属蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂是最重要，也是研究最为广泛的蛋白酶抑制剂之一。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡，是维持生物体内环境稳定的重要因素，存在于有些动物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂可能在脑缺血或兴奋毒性引起的神经元死亡中起重要的作用，可能具有神经保护作用。另外在于某些动植物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制其致病性微生物的蛋白酶活性，从而在针对外源侵染过程中发挥主动防御能力。丝氨酸蛋白酶抑制剂一般为单一肽链蛋白质，丝氨酸蛋白酶抑制剂分子一般由29-190个氨基酸组成，较多为400个左右。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列同源性、二硫键的数目和三维结构，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为多个不同的超家族，如胰腺胰蛋白酶抑制剂(英文名称：Kunitzinhibitor)家族、胰腺分泌类胰蛋白酶抑制剂(英文名称：Kazal inhibitor)家族、链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(英文名称：streptomyces subtilisininhibitor)家族、Bowman-Brik型抑制剂家族，等。现在研究较多的是Kunitz型氨酸蛋白酶抑制剂，该类抑制剂来源非常广泛，现在已经从猪胰脏、海葵、人尿、蛇、大豆、赤小豆、天花粉、海芋、苦豆子、花生、太湖蓝藻等动植物中分离得到。其三维结构高度保守：由一个明显的疏水核心、三对高度保守的二硫键桥、三链β-折叠和一个C端α-螺旋组成，该类抑制剂家族的研究以抑肽酶BPTI的研究为代表。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂是较为保守的家族之一，其存在于鸟蛋、昆虫、小龙虾、哺乳动物组织和体液中，它们与血凝、纤维蛋白溶解、胚胎发生、个体发育、炎症和免疫应答等有着密切关系。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂通常由一个或者多个重复保守的结构域组成，其结构域序列较为保守，并且其分子构象高度保守。另外，许多Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂通常有一段信号肽，位于N末端，其长度大约为20个氨基酸。Bowman-Brik型抑制剂首先由Bowman等于1944年利用丙酮为不溶因子从大豆中分离出来的，分子量为6000-10000，含有大量的半胱氨酸。Bowman-Brik型抑制剂是由71个氨基酸组成的单肽链，包含7个二硫键，BBI一般含有2个活性中心：一个是赖氨酸16-丝氨酸17；另一个是亮氨酸44-丝氨酸45，因此该类抑制剂可以同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。

在人类及高等动物中，许多丝氨酸蛋白酶存在于血液中，与凝血、纤溶有关。除存在于血液中外，某些蛋白酶还存在与中枢神经系统，对于中枢神经系统的动态平衡起重要作用。而相应的丝氨酸类蛋白酶抑制剂可以调节血液的凝集，并对于脑损伤及神经变性起着极为重要的作用。在生物体中，丝氨酸蛋白酶的活性取决于其同源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(英文名称：serpin inhibitor)的平衡。这些serpins作为其靶蛋白酶的假性底物与酶的反应部位紧密结合，在凝血、纤溶、炎症和免疫方面起着重要作用。例如serpins可通过细胞外基质的蛋白溶解过程的调节，在神经迁移，轴突生长或成熟后突触连接的过程中发挥重要作用。t-PA是存在与血液中的重要纤溶酶原激活剂，属于丝氨酸蛋白酶类，在脑和胚胎发育中，与细胞移行、血管生成和组织在中枢神经系统的重塑有关，该酶的抑制剂I型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-I)可快速抑制该酶，从而在动物体内发挥重要作用。牛胰蛋白酶抑制剂(英文名称：Bovinepancreatic trypsin inhibitor，BPTI)和人体中的淀粉样β-蛋白前体(英文名称：Amyloid beta-protein precursor，APP)都属于Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们不仅抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶和纤溶酶，还同时抑制血浆激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶，在临床广泛用于手术后的止血及术后并发的炎症反应。另外BPTI和APP对于因子XIa、，因子XIIa也有抑制作用，从而可以直接抑制外源性的凝血系统。