[发明专利]基于聚合物微球变化的编码检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用检测技术领域，主要涉及一种基于聚合物微球变化的编码检测方法。本发明是建立在免疫反应以及基因杂交特异性反应的基础上，对编码技术的创新，可同时实现多个待测样本或指标的检测，简单、快速、可靠。

背景技术

在生物医学领域中，人们对生命现象的观察和研究已经深入到单细胞、单分子水平。生物医学检测技术是现代生命科学与医学发展的重要手段和实验工具，尤其是对感染性疾病、遗传性疾病和恶性肿瘤等的临床诊断具有极其重要的作用。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在功能水平上对细胞或其他生物粒子定量检测和分选的分析方法，在生物床医学领域应用广泛。细胞或粒子在激光束的照射下产生散射光和激发荧光，这两种光信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT)接收。光散射信号在前向小角度进行检测，称为前向散射(forward scatter，FSC)，这种信号反映了微球粒径或体积的大小；90°散射光又称侧向散射(side scatter，SSC)，是指与激光束-液流平面垂直的散射光，其信号强度可反映微球内部复杂程度。检测后的信号经计算机处理后即转化为可直观观察的一维直方图或二维散点图。流式细胞仪的分辨率主要取决于仪器本身，常用变异系数(Cv)来表示，Cv＝d/m×100％(d是分布的标准偏差，m是分布的平均值)。近年来，流式细胞仪在技术原理和设计研制方面无突破性进展，但在各种功能上却有了很大提高，尤其是荧光探针的不断推陈出新，使流式细胞仪新的参量分析方面不断有新的发展，并使仪器不断向小型化，操作自动化、简单化方向发展。顾忠泽等(CNl595149A)发明一种基于编码微球的微流控生物芯片，是基于流式细胞术原理发展的一种新的检测技术。

编码技术是目前用于医学检测以及科学研究的关键技术，是将待检测的信息转换为微球颜色、粒径或者磁性等能快速、准确检测的信号，便于判断和筛选。Chandler等(美国专利，US626822)利用聚苯乙烯纳米微球，溶胀吸附荧光物质实现了编码。颜晓梅等(CN101392172A)制得了粒径均一的、羧基化荧光编码微球。苏星光等(CN101530766A)发明了磁性荧光编码微球，集磁响应与荧光编码于一身，在应用方面具有很大优势。但是由于荧光物质本身发光效率和稳定性难控制、不同波长荧光效率差别显著等引发的问题仍然存在。目前应用较多微球聚合方法主要包括分散聚合、悬浮聚合、乳液聚合、种子聚合、SPG膜乳化法等。20世纪八十年代Ugelstad等开发了种子溶胀聚合法，通过引入惰性溶剂和单体一起溶胀单分散种子微球，可以用来制备单分散的聚合物微球。目前对种子溶胀聚合的理论和方法已经相当成熟，通过二步种子溶胀聚合可以获得不同系列粒径、高度均匀的功能化微球，不仅可以获得高交联度的致密微球，还能获得介孔或微孔球。由于微球表面带有功能基团，特别是羧基基团，可以与抗体、抗原以及基因片段结合成为诊断微球。诊断微球基于免疫反应或基因杂交特异性反应，特异地识别待测物质，通过流式细胞仪检测即可准确判断样品中是否含有该物质或诊断患者是否患有某种疾病。

目前很多液相生物芯片的载体微球采用荧光微球，由于微球荧光负载不均匀、稳定性差、容易发生泄漏、不同荧光波长的荧光效率不同，且荧光染料的成本较高、过程复杂，在生物医学检测方面应用受限；对微球的要求高，不但要求微球高度均匀，表面官能团富集而且能有效、稳定的包埋小分子。如何既能实现多通量同时检测、又能使操作简单、检测信号稳定性强、区分度高，且成本低廉的编码技术，一直受到研究人员的广泛关注。

发明内容

本发明旨在提供一种易于检测、准确区分，同时实现多通量检测的基于聚合物微球变化的编码检测方法，可广泛应用于生物学、临床医学、免疫学、药学等生物医学检测领域。

本发明提供了基于聚合物微球变化的编码检测方法：

本发明采用表面偶联特异性的抗体、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒径和内部结构的聚合物微球，通过免疫反应或基因杂交反应特异性识别待测样品中的抗原、抗体、DNA或RNA片段；用表面携带荧光物质的分子探针与待测的抗体、抗原、DNA或RNA片段特异性偶联，使得微球表面呈现荧光颜色；在检测仪器中检测荧光信号，与阴性和阳性对照标本或已知浓度的标准品对比，判断待测样品是阴性或是阳性；在检测仪器中对微球粒径和内部结构进行表征，根据微球粒径和内部结构与检测信息的一一对应关系，从而对待测物质进行准确判断。

所述的聚合物微球是不同交联度的致密微球、介孔或微孔球；微球的粒径为2～30μm，相邻编码微球粒径间隔在1～10μm。