[发明专利]一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎，猪流行性腹泻是目前证实的引起猪发生腹泻的重要的两个病毒性传染性病。这两种疾病主要对仔猪的影响较大，是引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病。这两种病常常混合感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常相似，很难区别到底是哪一种病毒感染，而且发病急速，在发病后近几个小时就可波及全群，主要是造成哺乳期仔猪的大批死亡，给养猪生产造成巨大的损失。

猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus，TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染病，对新生仔猪具有高度致死率，通常为100％。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上的猪感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美国首次报道了这一疾病以后，世界上许多国家都相继报道了猪传染性胃肠炎。我国从1956年在广东省首次发生这种疾病后，全国大多数省份也有猪传染性胃肠炎的发生，给养猪业带来了严重危害。

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhae，PED)是冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus，PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。各种年龄的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最为严重。猪流行性腹泻主要发生在冬季和早春天气较为寒冷的季节，但在夏季也可发生。上世纪70年代初期许多国家相继报道了猪流行性腹泻的发生，我国上世纪80年代开始陆续有发生猪流行性腹泻的报道。

目前主要用疫苗免疫母猪来预防这两种疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特效药物，因此在临床治疗上主要采取对症治疗和用抗生素类药物预防并发症的发生，其治疗效果不理想。此外，由于这两种疾病发病急速，出现腹泻后，仔猪大多由于腹泻而脱水，很快就会衰竭而死亡。因此，在生产中急需一种既具有特异性，疗效又确实，治疗效果迅速显现的治疗制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法。

本发明的免疫原采用细胞培养物加油佐剂乳化制备而成，其中猪传染性胃肠炎病毒用猪肾细胞(PK15)传代细胞培养；猪流行性腹泻病毒用非洲绿猴肾细胞(Vero)传代细胞进行培养；这两种病毒的病毒含量都≥10^6.0TCID₅₀/ml，将这两种病毒以体积比(1～3)∶(1～3)的比例混合后与油佐剂以1∶2体积比乳化后作为免疫原，免疫非免疫产蛋鸡，收集蛋黄进行蛋黄抗体效价检测，选择高效价的蛋黄提纯蛋黄抗体。该抗体经口服后直接作用于仔猪肠道，以治疗和预防传染性胃肠炎病毒(TGEV)和流行性腹泻病毒(PEDV)感染。

为达到上述目的，本发明采用下列技术步骤：

一、TGEV抗原的制备

将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立细胞对照，37℃ CO₂培养箱中培养，24h后倒掉维持液进行换液，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液冻融后离心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时收毒，冻融，离心分离，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩后用作抗原。

二、PEDV抗原的制备

将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同时设立细胞对照，37℃ CO₂培养箱中培养，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液冻融后于离心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时，收获细胞悬液，冻融后于离心分离，收集上清液，浓缩后用作抗原。

三、蛋黄抗体的制备

1.动物免疫