[发明专利]重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株(SC/AAca)的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组基因工程疫苗，具体地，本发明涉及一种用于预防动物和人甲型H1N1流感的重组基因工程疫苗，更具体地，本发明涉及一种用于预防动物和人甲型H1N1流感的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株。

背景技术

A型流感病毒是一种能广泛感染禽类和哺乳动物的分节段的负链RNA构成的囊膜病毒。在全世界，流感常以零星暴发兼杂随机的大流行的形式出现，在过去的几十年里，各国家主要选择利用的仍然是全病毒灭活疫苗，它主要刺激机体产生体液免疫抵抗相同亚型的血凝素表面糖蛋白。

截至2009年12月，开始于墨西哥的甲型H1N1流感的大流行，已在全球造成超过1万人死亡，并且疫情仍在继续扩大。为了对应疫情的发展，我们进行了冷适应活疫苗株的研制。

AH/AAca是以AA/ca疫苗为6个内部基因(PB2，PB1，PA，NP，M和NS)供体，以我国流行的抗原性具有代表性的H5N1亚型人禽流感病毒，A/Anhui/2/2005(我国人禽流感分离株，简称AH/05)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，同时删除了高致病力相关的HA裂解位点多个碱性氨基酸，通过流感病毒反向遗传操作，在符合人类疫苗生产标准的低代次Vero细胞上救获的基因重组病毒。该重组冷适应致弱病毒具有冷适应性(cold-adapted，ca)和温度敏感性(temperature-sensitive，ts)，感染复制局限于上呼吸道，可直接鼻腔喷入接种，免疫原性良好，且具有高度生物安全性(Fan S et al.，2009)。冷适应性是指重组活疫苗株在25℃低温培养条件下能很好地生长，而相应的野生病毒却不能在此条件下生长。温度敏感性是指重组活疫苗株在39℃高温培养条件下生长受到限制，而其野生病毒在此条件下却能很好的生长，而病毒的这两种生物学特性是由其内部基因决定的。

人工自然重组技术是一种简单有效的构建2:6重组病毒疫苗株方法，流感病毒的基因组由8个分段的负链RNA片段组成，当2个病毒共同感染鸡胚或细胞时，其基因组片段会发生互换，从而产生一些新的重组病毒(reassortant)，通过血清的处理，则能够有效的筛选2:6重组病毒疫苗株(H.Chen et al.，2003)。

发明内容

鉴于全病毒灭活疫苗免疫原性差、需要添加佐剂、生产比较困难、副反应大、不适合于有慢性疾病的人群、老人和3岁以下儿童的使用。因此，本发明人利用人工自然重组方法，以2009年世界大流行的甲型流感，中国内地首例甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009(简称SC)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，以流感病毒疫苗株AH/AAca(H5N1)为6个内部基因(聚合酶PB2(PB2)，聚合酶PB1(PB1)，聚合酶PA(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS))的供体，自然重组得到了1株基因重组病毒，命名为SC/AAca(H1N1)。即，以AH/AAca(H5N1)的6个内部基因作为骨架基因，并以2009年流感大流行国内甲型流感病毒分离株A/SC/1/2009的HA和NA基因作为表面基因，利用自然重组方法，制备了重组病毒SC/AAca(H1N1)。

实验证实，该株病毒具有体外培养ca和ts特性，只能在小鼠呼吸系统内复制，呈典型的冷适应低致病力表型。该病毒与我国甲型H1N1流感病毒流行株抗原性一致，并且具有良好的鸡胚适应性，可作为防制甲型H1N1流感的疫苗株。

因此，本发明提供以下各项：

1.一种重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其特征在于表达甲型H1N1流感病毒的表面抗原血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白。

2.根据以上1所述的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其还表达冷适应疫苗株的6个蛋白：聚合酶PB2亚基(PB2)，聚合酶PB1亚基(PB1)，聚合酶PA亚基(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)。

3.根据以上2的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其中所述冷适应疫苗株是流感病毒冷适应致弱病毒疫苗株AH/AAca(H5N1)。

4.根据以上1至3中任一项的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其中所述表面抗原血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白的氨基酸序列来源于甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009。

5.一种生产根据以上1-4任何一项的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株的方法，该方法包括：

(1)用甲型H1N1流感病毒株和冷适应疫苗株共同接种鸡胚尿囊腔或细胞进行自然重组；