[发明专利]一株以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮微生物菌株的选育

说明书

技术领域

一株以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮微生物菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。

背景技术

3-羟基-2-丁酮，英文名为3-Hydroxy-2-Butanone，又名乙偶姻(Acetoin)，为淡黄色液体，长期放置生成二聚体，微溶于水和乙醇、丙二醇等有机熔剂，熔点15℃，沸点143～148℃，能自燃。

3-羟基-2-丁酮自然界存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中。是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，并且在其它众多行业中也有广泛的应用。

在食品中的应用：主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生产，国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料。80％含量的3-羟基丁酮俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个极其重要的品种。该产品因其应用范围极其广泛，用量也较大，是奶用、酒用香料中的重要品种。在制药行业采用3-羟基-2-丁酮和光气为原料合成重要医药中间体CDMDO，3-羟基丁酮还可以合成抗菌药伦氨苄西林盐酸盐。在化工行业3-羟基-2-丁酮可以合成起泡剂、杀菌和杀虫剂，含氯聚合物的稳定剂，另外3-羟基-2-丁酮还是一种昆虫的性激素。

3-羟基丁酮生产方法主要包括化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法生产3-羟基-2-丁酮存在着产品收率和得率较低，且环境污染较严重等缺点，而且产品质量很难达到目前3-羟基丁酮的最大消费领域——食用香料的要求；更为严重的是这三种工艺的原料来源受阻，导致了适用化学法生产3-羟基-2-丁酮难以大规模发展。酶法转化法生产3-羟基-2-丁酮产物得率高，没有其它副产物，并且产物具有旋光度，但要获得大量特异性的酶比较困难。发酵法生产3-羟基-2-丁酮首先成本较低，其次对环境污染也较小，并且以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基-2-丁酮大大减轻了原料来源的限制。目前，发酵法生产3-羟基-2-丁酮的方法，国内外还大都处在研究阶段。

本发明筛选到以葡萄糖为底物高产3-羟基-2-丁酮的微生物菌株，对该菌进行了鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，对其发酵条件进行了初步研究，为微生物发酵法产3-羟基-2-丁酮的工业化提供了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供：从自然界的土壤中筛选到能够以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为Bacllius subtilis JNA。对发酵产物进行了定性定量检测分析，为微生物发酵法生产3-羟基-2-丁酮的工业化提供了有益的指导。

本发明的技术方案：一种通过微生物发酵产3-羟基-2-丁酮的方法，是在初始发酵培养基中，以从自然界土壤中筛选的菌株为生产菌株，在装液量为4L的7L发酵罐中37℃、350r/min、通气量为1L/min的条件下培养130h，通过气质联用(GC-MS)定性检测发酵液中物质成分然后再通过气相色谱定量检测发酵液中物质的含量，筛选出能以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮的菌株。本发明成功筛选到一株能以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮的菌株，通过16S rDNA鉴定，将其命名为Bacllius subtilis JNA，已于2009年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 209309。

主要试剂：

Acetoin 购自美国TCI公司

3-羟基-2-丁酮分析方法的确定：

3-羟基-2-丁酮标样在PEG-20M柱上通过气相色谱进行分析，保留时间为12.7min。所用气相色谱仪为日本岛津(Shimaduz)，色谱柱：PEG-20M 30M I.D.0.32mm

确定具体色谱条件为：色谱柱：PEG-20M 30M I.D.0.32mm；顶空进样，样品平衡温度：70℃；平衡时间：30min；进样温度：200℃；检测器温度：250℃；程序升温：40℃(5min)-180℃，升温10℃/min。