[发明专利]使用实时PCR检测HBV的方法

说明书

技术领域

本发明涉及乙肝病毒基因的检测。更具体地，本发明涉及与HBV基因互补的引物对，包含与HBV基因互补的引物对和探针的HBV检测用组合物，包含所述组合物的HBV检测试剂盒，以及用于检测HBV基因的方法。

背景技术

已知乙肝病毒(下文称为HBV)是病毒性肝炎的主要原因，据估计在世界范围内有20亿人感染HBV。在这些感染人群中，约3.5亿人是慢性携带者，且大多数人有逐渐发展为肝硬化和肝细胞癌的风险。HBV包膜基因由preS区(包含preS1和preS2)以及S区组成。在全部包膜基因转录后，分别通过在三个区中每一个的可变翻译来合成三个包膜蛋白(L蛋白、M蛋白和S蛋白)。翻译起始于preS1区的L蛋白由约400个氨基酸组成，所述氨基酸包含全部的preS1域、preS2域和S域。翻译起始于preS2区的M蛋白由约281个氨基酸组成，所述氨基酸包含preS2域和S域。S蛋白由约226个氨基酸组成，所述氨基酸仅包含S域，其表达量最大，从而成为病毒颗粒的主要组分。包膜蛋白的S域彼此结合以形成作为S抗原的颗粒。M蛋白和L蛋白中包含的preS1和preS2域位于所述颗粒的外侧，且起到诱导高免疫应答的preS抗原的作用。

HBV感染的诊断可通过检测样品中存在的抗HBV抗体，检测HBV抗原或检测HBV基因来进行。

HBV抗原的检测方法通常使用HBV表面抗原(HBsAg)或HBV e抗原(HBeAg)作为诊断标记物来检测其是否存在于血液中。然而，病毒的生命周期会妨碍HBV感染的早期诊断。在治疗期间，HBV感染患者血液中HBsAg或HBeAg的减少或缺失也会妨碍对患者体内HBV的正确诊断。

HBV基因检测可通过核酸扩增技术(NPT)或DNA探针法进行。目前，这些方法广泛地用在临床实践中。特别地，PCR是选择性地将少量靶基因扩增到可检测水平的方法，因此得到广泛的应用。然而，问题在于DNA提取方法不可避免地导致DNA损失。例如，即使样品包含足量的靶DNA以作为扩增模板，但由于提取过程中的损失，无法回收到适合用于扩增的量的DNA，导致模板扩增效率降低。因此，难以充分扩增并检测样品中的靶DNA。因此，此技术产生假阴性结果，且由此而难以保证结果的正确性。即使使用相同的样品，提取过程中DNA产量的变化也会产生不同的结果，导致缺乏重复性。也就是说，DNA扩增技术的问题在于其要求DNA提取过程引起样品中痕量靶DNA损失，从而使检测灵敏度降低。此外，当样品液体中包含扩增抑制剂(如肝素、表面活性剂、蛋白变性剂、有机溶剂等)时，扩增效率也降低，从而使检测灵敏度减小。

此外，遗传变异极低的区，如S蛋白区、前核心区(pre-Core region)或包膜蛋白可用于通过PCR的HBV检测。然而，这些区也具有低概率的变异，如突变。如果在碱基序列中发生遗传变异，使用PCR引物和/或探针的扩增步骤失败。因此，由于扩增效率的降低导致获得假阴性的结果或降低检测灵敏度。因此，难以保证准确的定量。

发明内容

技术问题

本发明的发明人已进行了许多努力来解决这些问题。本发明的发明人已经开发出使用样品中包含的痕量靶HBV基因来准确且快速地检测并定量HBV基因的方法，以及同时检测并定量具有极小遗传变异(如突变)的HBV基因两个区的方法。根据这些方法，即使在基因的一个区中发生通过突变的遗传变异，也能够检测此基因的其它区，从而高灵敏度和特异性地完成疑似感染HBV患者的正确诊断，从而完成本发明。

技术方案

本发明的目的是提供与HBV基因互补的引物对，其碱基序列如SEQ IDNO.1和2，或SEQ ID NO.3和4所示。

本发明的另一个目的是提供用于检测HBV基因的组合物，其包含具有碱基序列SEQ ID NO.1和2的引物对、具有碱基序列SEQ ID NO.3和4的引物对和具有SEQ ID NO.7和8所示碱基序列的探针。

本发明的另一个目的是提供HBV检测试剂盒，其包含所述用于检测HBV基因的组合物。

本发明的另一个目的是提供使用所述用于检测HBV基因的组合物来检测HBV基因的方法。

附图说明

图1是显示能够进行阳性检测和定量而没有内标对HBV特异性引物和探针竞争性抑制的结果；

图2显示HBV定量标准的线性；

图3显示PCR结果，其中分别进行HBV S蛋白和前核心区的扩增；和

图4显示PCR结果，其中同时进行HBV S蛋白和前核心区的扩增。在该情况下，检测中同样没有竞争性抑制，且定量中无显著差异。

有益效果