[发明专利]一种β-琼胶酶编码基因及基因获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种β-琼胶酶编码基因及其基因获取方法。

背景技术

琼胶酶(agarase，EC 3.2.1.81)是一种可以降解琼胶的糖苷水解酶，主要存在于微生物中，以海洋细菌最为突出。最先由Gran于1902年从海水中分离到一株琼胶降解菌，80多年后由Buttner MJ等人首次克隆到一个琼胶酶基因，开启了人类对于琼胶酶的认识。到目前为止发现的琼胶酶组成了一个较大的家族，根据其作用方式不同，可分为α-和β-琼胶酶。α-琼胶酶降解琼胶的α-1，3糖苷键，生成不同聚合度的琼寡糖产物；β-琼胶酶降解琼胶的β-1，4糖苷键，生成不同聚合度的新琼寡糖产物。根据氨基酸序列相似性，琼胶酶又可分为不同的Glycoside Hydrolases(GHs)家族：α-琼胶酶的GH96家族；β-琼胶酶的GH86、GH50和GH16家族。迄今只报道了两个α-琼胶酶，大部分都是β-琼胶酶，其中又以GH16家族占据优势。

琼胶酶的产酶菌多为海洋细菌。通过查阅资料、文献检索所知，Alterococcus、Alteromonas、Bacillus、Cytophaga、Microscilla、Microbulbifer、Pseudoalteromonas、Pseudomonas、Streptomyces、Zobellia等属中的某些菌株可产生琼胶酶。

中国专利200410023656.1报道了一种从我国南海海域分离的生产琼胶酶的新菌种Alteromonas sp.nov.SY 37-12(CCTCCM204009)。中国专利200810121997.0报道了一株分离自东海沉积物的生产琼胶酶的新菌种需钠弧菌(Vibrio natriegens或简写为V.natriegens)，菌种保藏号为CGMCC No.2428。上述专利重点针对产酶菌株，单一菌株往往具有多种琼胶酶的同工酶基因。

目前大多数研究者都是采用文库构建的方法获取琼胶酶基因。但是文库构建需要花费大量时间和精力，通过筛选数千个克隆才能获取阳性克隆，之后还要进行亚克隆等环节。若有一种方法能基于同源克隆而直接从基因组中通过PCR扩增出目的基因部分序列，则可以免去上述构建文库的繁琐工作，从而实现目的基因的高效获取。然而由于琼胶酶家族多、公布的序列有限、彼此间差异较大，很难根据普通的克隆方法得到核心序列。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从生产琼胶酶的菌株中克隆琼胶酶基因的方法，开辟一条新的、快捷的途径，并将获得的琼胶酶基因用于重组菌株的构建并实现异源表达，最终实现工业化生产琼胶酶。

本发明的另一目的是利用该方法克隆到一个全新的β-琼胶酶基因。

本发明所述的方法包括如下步骤：

(1)将已知琼胶酶进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列；

(2)设计兼并引物；

(3)以菌株基因组为模板，利用兼并引物经PCR方法扩增琼胶酶基因的核心DNA序列；

(4)利用位点步进PCR方法扩增琼胶酶核心序列的侧翼序列，进而拼接得到琼胶酶全基因序列。

该方法将目前发表的所有琼胶酶按照不同的家族如GH16、GH50、GH86和GH96等进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列，或者也可以直接在软件Block Maker(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/blockmkr/www/make_blocks.html)中进行比对和寻找保守区域，然后利用软件CODEHOP(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html)寻找可能的兼并引物。依据引物的基本原则和要求：简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的TM值尽可能相近等，选择适宜的兼并引物。