[发明专利]一种纳喷毛细管高压液相色谱柱及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，更具体地，本发明公开了一种纳喷毛细管高压液相色谱柱及其制备方法。

背景技术

液相色谱和质谱串联使用已经成为分析化学和蛋白质组学研究领域的通用技术平台。石英材质的毛细管液相色谱微柱由于具有高分辨率、高灵敏度和高精度等特性，得到了广泛的应用，已经成为高通量蛋白质组学技术平台的必需组分和基础(Link，A.J.；Eng，J.；Schieltz，D.M.；Carmack，E.；Mize，G.J.；Morris，D.R.；Garvik，B.M.；Yates，J.R.，3rd，Direct analysis of protein complexes using massspectrometry.Nat Biotechnol 1999，17(7)，676-82.)。低阻力、低反压和高流速的石英材质毛细管液相色谱空柱是制备高分辨率、高灵敏度和高精度液相色谱微柱的前提。

早在1985年，Ibrahim等在毛细管的一端用玻璃状熔结物堵塞制成平端高压液相色谱柱(Ibrahim，M.；Nisamaneepong，W.；Caruso，J.，Microcolumn highpressure liquid chromatography with a glass-frit nebulizer interface for plasmaemission detection.J Chromatogr Sci 1985，23(4)，144-50)。Henzel等将同样方法制备的高压液相色谱柱与质谱联用分析多肽混合物，从而将这一技术引入蛋白质组学领域(Henzel，W.J.；Bourell，J.H.；Stults，J.T.，Analysis of protein digests bycapillary high-performance liquid chromatography and on-line fast atombombardment mass spectrometry.Anal Biochem 1990，187(2)，228-33.)。但这些平端的高压液相色谱柱由于多肽的离子化效率低，限制了蛋白质组学分析的灵敏度。Valaskovic等尝试了带尖端石英毛细管熔封技术，制备了带尖端的高压液相色谱柱。在该技术中，Valaskovic将可熔结的细小粒径材料微粒与易挥发溶剂制成悬浊液，并将拉制的带有锥形毛细管尖端的石英毛细管浸泡在这种液体中，通过毛细管的虹吸作用，这些细小粒径可熔结的材料被渗入毛细管。经蒸发干燥和熔结处理，这些可熔结的细小粒径材料被烧结并附在锥形毛细管尖端，由此形成带尖端的高压液相色谱柱(美国专利US5,997,746)。这种色谱柱可以使经分离和洗脱的多肽直接喷射进质谱。同时，由于使用了熔结的锥形毛细管尖端，减小了色谱分离后柱的死体积，减轻了宽的分离色谱峰现象，由此提升了分析的灵敏度。这种柱子同时也可减少柱子尖端被阻塞的几率，使系统更加容易操作。但由于毛细管柱尖端的内径较小，只有5-15μm，因此在Valaskovic的技术中只有更小粒径(如3~5μm，甚或更小)的可熔结材料才能渗入毛细管尖端。这种材料一旦熔结，其产生的中空间隙小，在填充柱子时尖端产生的反压大，柱子填充速度慢，单位时间内有效填充的柱长短，填充效率低。随着柱长的增加，填柱的反压呈指数式增加，因此在低压条件下能填装的柱子长度有限。在分离样品时，这种柱子的反压大，流速低，难于通过增加柱长来提高多肽样品的分离效率。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的申请人发展了充填了的石英质毛细管同步熔结拉制纳喷毛细管高压液相色谱柱制备技术，即本发明的申请人将Valaskovic的四步纳喷毛细管高压液相色谱柱制备流程(单根纳喷毛细管高压液相色谱柱制备过程包括毛细管除包被、毛细管尖端拉制、填柱、烧结等四个步骤)改进为三个步骤：可熔结大颗粒介质填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制从而可以使直径大于10μm以上的可熔结大颗粒介质被轻易装填入柱子。这些材料被熔结后，可以产生大的中空间隙，因此，在填充柱子时尖端产生的反压小，流速快、柱子填充速度快；在分离样品时，这种柱子的反压相对小，流速高，从而在通常的液相色谱上在相同的压力下，可以使用更长的色谱柱，因而也有效地提高了色谱柱的分辨效率。在柱子制备时，由于将毛细管除包被、毛细管尖端拉制、填柱、烧结等四步法制备一根毛细管柱为可熔结大颗粒材料填装、毛细管除包被和毛细管色谱柱拉制等三步法同时制备两根色谱柱，提高了工效。

具体地，本发明公开了一种纳喷毛细管高压液相色谱柱，流速与毛细管柱内径符合方程