[发明专利]一种提高植酸酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达植酸酶以提高该酶活性的方法。

背景技术

饲料中含有的植酸易与钙、磷等矿质元素形成不溶性沉淀，影响动物对这些矿质元素的吸收。植酸酶能够降解植酸，在饲料中添加植酸酶能够有效消除植酸对动物吸收钙、磷等矿质元素的不利影响。

但目前在饲料中添加的植酸酶主要存在以下问题：酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达。细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率。分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。

发明内容

针对现有的植酸酶催化效率低的问题，本发明提供一种将植酸酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高植酸酶活性。

本发明的一种提高植酸酶活性的方法，包括以下步骤：将植酸酶基因(Genbank号：AB508806)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号：M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号：AY428072)下游MF α1信号肽序列(Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MF α1信号肽序列+植酸酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。

将包含上述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有6％(重量百分比)半乳糖和6-9％乳糖(重量百分比)的YPD培养基中。

本发明的优点：将植酸酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高植酸酶活性。

具体实施方式

以下通过实施例进一步对本发明进行描述：

本发明开发一种将植酸酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高植酸酶活性。

三种酶分子表达方式如下：

—：酶分子

细胞内表达                     分泌表达                          展露表达

实施例1植酸酶展露表达

将植酸酶基因(来自Lupinus albus，Genbank号：AB508806)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(来自酿酒酵母表达载体pYES263，Genbank号：AY428072)下游MF α1信号肽序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框(从N端到C端)：GAL1启动子+MF α1信号肽序列+植酸酶基因+α凝集素。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)，则MF α1信号肽将引导植酸酶向酿酒酵母细胞外分泌，而植酸酶下游的α凝集素则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使植酸酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。

实施例2植酸酶展露表达的诱导

在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加6％半乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo.，Ltd.)和6-9％乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology&Services Co.，Ltd.)，则表达框“GAL1启动子+MF α1信号肽序列+植酸酶基因+α凝集素”中的GAL1启动子就会活化，诱导植酸酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。

实施例3半乳糖和乳糖对植酸酶展露表达的作用

在培养酿酒酵母的YPD培养基中，如果不含半乳糖和乳糖，则未检测到植酸酶活性，这是因为表达框“GAL1启动子+MF α1信号肽序列+植酸酶基因+FLO序列”中的GAL1启动子无法保持活化状态。

实施例4植酸酶展露表达后活性的提高