[发明专利]一种提高脂肪酶活力持续性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达脂肪酶以提高该酶活力持续性的方法。 

背景技术

酯是一大类在化工、食品、医药等领域广泛应用的重要产品或中间体，仅用作食用香料的酯即达数百种。各种酯的合成路线相同，均以羧基供体(如酸、酸酐)和羟基供体(如醇、淀粉等)为原料，通过酯化反应制备。 

脂肪酶能催化许多种酯的生物合成。与酯的化学合成相比，酯的生物合成具有效率更高、反应条件温和、能耗低等优点。但目前应用的脂肪酶存在酶活力持续性不足这一问题。包括脂肪酶在内的各种酶的重组表达方式有细胞内表达和分泌表达两种，这两种酶的重组表达方式使酶分子与宿主细胞之间没有关联，即酶分子不是宿主细胞的组成部分，从而很容易失活。如果使酶分子成为细胞的有机组成部分，则只要细胞保持存活状态酶分子也会保持活力，从而可以显著提高酶的活力持续性。 

本发明开发一种使脂肪酶成为酿酒酵母细胞有机组成的技术，即将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接而成为酿酒酵母细胞的组成部分，只要酿酒酵母细胞保持存活则脂肪酶始终保持活性状态，从而显著提高了脂肪酶活力持续性。 

发明内容

针对现有的脂肪酶活力持续性不足的问题，本发明提供一种使脂肪酶成为酿酒酵母细胞有机组成部分的技术，使脂肪酶只要酿酒酵母细胞保持存活即可保持活力，从而显著提高脂肪酶活力持续性。 

本发明的一种提高脂肪酶活力持续性的方法，包括以下步骤： 

将脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)连接(常规方法)在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列(Genbank号：S73336)的N端，然后插入(常规方法)酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号：AY428072)下游MF α1信号肽序列(Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1 启动子+MF α1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。 

将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有4.2-6.8％(重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培养基中 

本发明的优点：将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接，如此则只要酿酒酵母细胞保持存活状态，脂肪酶即可保持活力。 

具体实施方式

以下通过实施例进一步对本发明进行描述： 

实施例1脂肪酶展露表达 

将脂肪酶基因(来自Rhizopus oryzae，Genbank号：AF229435)连接在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：S73336)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(来自酿酒酵母表达载体pYES263，Genbank号：AY428072)下游MF α1信号肽序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框(从N端到C端)：GAL1启动子+MF α1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)，则MF α1信号肽将引导脂肪酶向酿酒酵母细胞外分泌，而脂肪酶下游的FLO序列则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使脂肪酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。 

实施例2脂肪酶展露表达的诱导 

在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加4.2-6.8％半乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo.，Ltd.)，则表达框“GAL1启动子+MF α1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GAL1启动子就会活化，诱导脂肪酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。 

实施例3半乳糖对脂肪酶展露表达的作用 

在培养酿酒酵母的YPD培养基中，如果不含半乳糖，则未检测到脂肪酶活性，这是因为表达框“GAL1启动子+MF α1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GAL1启动子无法活化。 

实施例4脂肪酶展露表达后其活力持续性显著提高