[发明专利]博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶的原核表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶蛋白(FDH)的原核表达载体pET28a-FDH及其在FDH蛋白的原核表达和制备FDH重组蛋白中的应用。

背景技术

甲酸脱氢酶(FDH，EC 1.2.1.2)在有生命的生物体中广泛分布，FDH催化甲酸氧化成二氧化碳并在此过程中还原NAD⁺成NADH。甲酸脱氢酶(FDH)是广泛存在于甲基营养型细菌，酵母以及高等植物和动物中的一个酶家族。根据其四级结构、辅基的存在和类型以及底物特异性，分为几种不同的类型。其中一类是NAD⁺依赖的甲酸脱氢酶，催化甲酸离子氧化成二氧化碳，在NAD+的耦联反应中形成NADH。该类型的甲酸脱氢酶由两个相同的亚基组成，不含金属离子和辅基，对甲酸和NAD⁺具有高度的专一性。

由于FDH反应的不可逆性以及能适应较宽的pH条件，这种酶在最适pH下对许多工序是一种多用途的高效生物催化剂，因此甲酸脱氢酶具有相当大的生物技术应用潜力。FDH可用于在有机合成中发展NAD+再生系统，用来生产高附加值产品。德固赛公司(德国)最近开始使用商业技术制造叔丁基-L-亮氨酸，用FDH作为NADH再生的催化剂，这在药物化学中是一个最大的酶法工艺。来源于耐热微生物的FDH有较好的耐热性能，因此具有很好的工业应用价值。微生物甲酸脱氢酶的研究特别受重视，其中研究最多的是甲基营养型细菌和酵母FDH的特性、结构和催化机制等。

近年来，甲酸脱氢酶在辅酶再生中的应用已成为辅酶酶法再生研究领域的热点之一。它主要应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统中，所谓的酶耦联就是利用2个平行的氧化还原反应酶系统，1个酶催化底物转化，另1个酶则催化辅酶NADH循环再生。甲酸/甲酸脱氢酶体系是最成功的再生系统，它具有诸多优点：(1)FDH容易得到，且适宜的pH范围宽，易于实现再生反应与合成反应的有效耦合；(2)甲酸是最廉价的氢源之一；(3)甲酸在FDH作用下转化为二氧化碳，可直接从产物中分离出去，使反应接近于不可逆过程；(4)甲酸的存在并不会影响体系中另一氧化还原酶的活性。甲酸脱氢酶在工业NADH再生中的应用已在酵母和细菌中被广泛研究。

此外，甲酸脱氢酶还有相当大的农学应用潜力。例如，FDH可用作诊断酶在溶液和生理体液中用于测定甲酸和草酸的含量。在研究多种胁迫条件对FDH的影响时，可产生一些抗胁迫植株，如抗旱和抗冻等，这在农业生产上具有很大的应用价值。

博伊丁假丝酵母是一种甲基营养型酵母菌，能以甲醇为碳源生长，FDH催化甲醇氧化途径的最后一步反应，在博伊丁假丝酵母的甲基营养生长中起很重的作用，来自博伊丁假丝酵母FDH是个由两个性质完全相同的亚基构成的二聚体，每个亚基由364个氨基酸构成，都有各自的活性中心。与其他生物的FDH相比，博伊丁假丝酵母FDH具有较高的活性(6U/mg蛋白)，对NAD和甲酸也具有较高的亲和性(NAD的Km值为0.04mM，甲酸的Km值为2.4mM)，对热稳定性也比较好(Labrou和Rigden，Biochem.J.2001，354：455-463)，因此该酶可能具有较好的应用前景。

用较低的成本和简便的方法快速生产并纯化有活性的FDH蛋白是满足其工业应用的必需条件，而FDH蛋白特异性抗体是检测植物中FDH蛋白表达水平的有效工具。但现有研究中还未有制备博伊丁假丝酵母FDH的抗体报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种FDH的原核表达载体(pET28a-FDH)，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和FDH基因及一个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆菌(BL21)，可实现FDH蛋白的高水平表达。表达的重组蛋白质40％为可溶性蛋白，用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组FDH蛋白质，用于FDH酶制剂的生产以及生化特性分析。其余60％以包涵体形式存在，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FDH蛋白，再从凝胶中回收FDH蛋白可得到纯度极高的FDH蛋白，用于抗体的制备。FDH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FDH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

FDH的原核表达载体pET28a-FDH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和FDH基因及一个组氨酸标签。