[发明专利]一种抗草甘膦5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和植物遗传工程学领域，具体的说。本发明涉及一种抗草甘膦基因以及该基因编码的蛋白质。可以通过遗传转化的方法使该基因在植物体内表达从而提高植物对草甘膦的耐受能力，方便农田中的杂草清除。本发明可以运用在作物的育种、植物细胞培养的筛选。

背景技术

草甘膦是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作物难以对它产生抗性，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。然而由于草甘膦无选择性的杀死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了它在农业上的应用。为了获得抗草甘瞵作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其中最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦的抗性。

草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机磷。该酶只在植物和微生物中存在，在动物体中不存在该酶。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。在一些极端环境下，如草甘膦工厂的废液池、长期喷洒草甘瞵的农田等，发现了部分细菌的EPSPS对草甘膦具有部分抗性，并且被分离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。

现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成醉不发生交叉反应，且两者间的氨基酸同源性低于50％。

在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如：CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987).CTP在叶绿体膜上从EPSPS酶上裂解下来，产生成熟的EPSPS。由于细菌及真菌来源的EPSPS基因不能编码植物蛋白所特有的转运肽(transitpeptide)序列，而EPSP合酶只有被转运到叶绿体中才能发挥其作用，所以必须人为为其添加一条转运肽序列。

发明内容

本发明通过一种全新的方法克隆到一种aroA基因，该基因编码的EPSPS具有很高的抗草甘膦能力，可以用来生产抗草甘膦植物，也可以作为微生物和植物细胞培养中的筛选标记。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种抗草甘膦基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID No：1。

序列表中的SEQ ID No：1由1602个核苷酸组成，其中前213bp编码高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；214-1602bp为psedomonas moraxellaceaeNo.1菌EPSPS基因序列，在核苷酸序列上，该基因不与任何内外专利序列存在同源性。

本发明所提供的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶名称为EPSPS-L1，是具有序列表中SEQID No：2氨基酸序列的蛋白质，其在细胞中能提高抗草甘膦能力。

序列表中的SEQ ID No：2由533个氨基酸组成，其中前71个氨基酸包含高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与任何已申请专利的氨基酸序列无同源性；72-533个氨基酸为psedomonas moraxellaceae No.1菌EPSPS蛋白序列，该序列与已报道的抗草甘膦EPSPS同源性最高的为68％(US 5627061、5633435)。