[发明专利]一种冬虫夏草DNA指纹高分辨率的显带检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于名贵濒危药用植物冬虫夏草DNA指纹高分辨率的显带检测方法。

背景技术

虫草属Cordyceps(Fr.)Link是一大类昆虫病原真菌，其特定的菌感染特定的昆虫后具有重要的药用价值的冬虫夏草[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.]是我国名贵药材。冬虫夏草性味甘、平，入肺、肾经，能益肺肾、止咳、补虚损、益精气、抗衰老、抗癌症，具有增强人体免疫功能和调节生殖的作用。天然冬虫夏草主产于西藏、云南、四川和青藏等地，种质资源丰富。但目前充斥市场的同属伪品种类繁多，品质高低各异。

目前，药用真菌冬虫夏草鉴定及鉴别方法亟待提高，传统的生药学鉴别方法多根据表观结构特征直接分辨和鉴定，常用的化学分析方法不够精确、高效，所需检测的样品量大从而对珍贵濒危中药造成浪费。DNA指纹检测现已广泛用于中药原料的质量检测和鉴定，但现有的DNA指纹检测方法中采用的放射显带方法和荧光显带方法均有一定局限性，放射显带方法对环境和实验人员均有高污染的风险，而荧光显带方法所用的仪器昂贵，难以普及，而低污染而应用普遍的传统聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染显带方法操作时间长、步骤多、采用试剂繁多，易造成现代的背景色浓、分辨率低、条带模糊，导致显带结果不准确。同时，冬虫夏草DNA指纹多态性丰富，对显带的操作要求甚为严格，现有技术很难得到高效准确的冬虫夏草高分辨率PAGE显带，从而难以为冬虫夏草性状指标-化学-分子系统提供可靠高效的评价体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了解决现有冬虫夏草鉴定及鉴别方法中用量大、不够精确高效，放射显带方法和荧光显带方法存在诸多缺陷，建立能完全适应冬虫夏草DNA指纹高分辨率的显带检测方法。

为此，本发明公开了一种冬虫夏草DNA指纹高分辨率的显带检测方法，包括冬虫夏草DNA的PAGE胶电泳步骤、胶固定步骤、胶染色步骤、胶显色步骤，其特征在于所述胶固定步骤中固定液为0.5％乙酸，所述胶染色步骤中染色液为0.1％-0.3％AgNO₃，所述胶显色步骤中显影液为1％-4％强碱和0.5％甲醛溶液。

在一些实施方式中，所述冬虫夏草DNA的PAGE胶电泳步骤中PAGE胶为3％-6％的PAGE胶，以利于冬虫夏草DNA的多态性的展现。

在一优选实施方式中，所述染色液为0.3％AgNO₃，DNA指纹多态性效果为60-80条带，显带更为清晰，背景适中，多态性丰富。

在一些实施方式中，所述强碱可为N_aOH或KOH，其中优选1％-2％N_aOH。

该发明建立了一种冬虫夏草DNA指纹高分辨率的显带检测方法。由于采用了DNA分子指纹方法和PAGE显带检测方法鉴别，冬虫夏草样品用量仅需50ng，大大节省了濒危植物药材用量，同时避免了放射显带方法和荧光显带方法的高污染性和昂贵等局限性，并将传统的4步(固定、染色、显色、终止)银染法省掉了终止反应的过程，在提高特异性的前提下缩短了时间。本发明所述显带检测方法减少药品污染，其强碱低浓度的策略可以较好降低冬虫夏草DNA指纹图谱PAGE显带的背景色，提高了分辨率，克服了弱碱耗时耗费等特点，同时，采用的另外，本发明省去了硫代硫酸钠和醋酸溶液，使得操作无需在通风橱中进行，使检测方法更为安全和经济。本发明为冬虫夏草的鉴定分辨等研究提供一种现代分子生物学技术的高分辨率显带检测方法。本发明缩短了研究时间，提高了研究效率和准确性，更切合冬虫夏草鉴定和鉴别的实际要求，得到高效准确的冬虫夏草高分辨率PAGE显带，从而为建立珍贵濒危中药材-冬虫夏草资源可持续发展系统奠定分子分析基础，为冬虫夏草性状指标-化学-分子系统提供可靠高效的评价体系。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明配置液体的比例和操作的具体步骤为：

实施例1

(1)冬虫夏草DNA的PAGE胶电泳步骤：用3％-6％的PAGE胶检测冬虫夏草DNA指纹图谱。

表1  聚丙烯酰胺凝胶浓度表