[发明专利]一种EV71病毒抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒抗体的制备方法，特别涉及一种EV71病毒抗体的制备方法。

背景技术

手足口病，英文名为：Hand-foot-and-mouth disease，是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，会导致死亡。

引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。

手足口病是全球性传染病，自1957年新西兰首次发现此病以来，世界大部分地区均有此病流行的报导，且近几年来每次爆发的规模跟持续的时间都在不断增长。

我国自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东等十几个省市均有报导。此病每隔2-3年便会爆发一次，每年的4-8月份为该病的流行期。我国以EV71型病毒感染居多。

EV71病毒属肠道病毒属(Enterovirus)的成员，EV71病毒株SHZH98基因序列病毒基因组为7408个核苷酸的正链RNA，编码约2194个氨基酸，其Genebank登记号为：AF302996.1，其序列如SEQ ID NO：1所示。

截止2009年4月份，全国已累计报告手足口病115618例，死亡50例，而此时该病才刚刚开始流行，还未达到高峰。

目前针还没有针对该病的疫苗，治疗上主要以预防为主，配合药物治疗，但是由于该病存在很多隐性感染，同时传播速度快，传播途径多，所以预防和控制该病难度很大。加上感染的大部分是5周岁以下的小孩，病程短发病急，稍有不慎就有可能危机到小孩的生命，所以该病已被我国纳入丙类传染疾病进行管理。因此开发EV71病毒的多克隆卵黄抗体的研究，具有广泛的社会需求和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EV71病毒抗体的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种EV71病毒抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)设计含有不同酶切位点的上、下游引物，扩增EV71病毒株SHZH98的抗原决定序列；

2)将扩增得到的抗原决定序列克隆到载体上，构建重组质粒；

3)将重组质粒转入细菌或真菌中进行表达，收集表达得到的抗原蛋白；

4)将抗原蛋白溶解，注射至动物体内，诱导动物产生抗体，收集、纯化得到抗体，所述抗原决定序列为EV71病毒株SHZH98的2439bp-3329bp、1713bp-3329bp、2439bp-3779bp。

优选的，上、下游引物中的酶切位点为EcoRI、XhoI的酶切位点。

优选的，产生EV71病毒抗体的动物为禽类。

本发明方法制得的抗体，可以阻止EV71病毒的感染，具有预防和治疗手足口病的功能。

本发明方法制得的抗体，可以直接添加在食品、保健品中，也可以阻止EV71病毒的感染，具有预防和治疗手足口病的功能。

采用抗原免疫禽类产生抗体，可以直接收集禽类卵，大大降低了抗体提纯的成本，制备速度快。

附图说明

图1是各抗体的免疫效果对比图。

具体实施方式

下面结合实例，进一步说明本发明。

以下实施例中：

EV71病毒由第四军医大学西京医院儿科惠赠，病毒分离自患儿咽拭子标本，检测鉴定均参考国家手足口病标本采集及检测技术方案，荧光定量PCR检测为阳性后，感染细胞分离扩增保存。当然，也可以使用其他可公开获得的EV71病毒，扩增得到本发明的抗原决定序列。

pGEX-4T1质粒、细菌BL21、大肠杆菌Rosetta，均由西北农林科技大学张智英教授惠赠。

将EV71病毒扩增，提取其总RNA，使用RT-PCR扩增所需片断。

抗原制备实施例1

1)使用上游引物：CCCGAATTCGGAGATAGGGTGGCAGAT(SEQ ID NO：

5)，下游引物：CCCCTCGAGGAGAGTGGTGATCGCTGC(SEQ ID NO：

6)，采用TouchDown-PCR扩增与EV71病毒株SHZH98基因序列的2439bp-3329bp(SEQ ID NO：2)一致的片断，片段大小891bp，上游引物中，GAATTC为EcoRI的酶切位点，下游引物中，CTCGAG为XhoI酶切位点；