[发明专利]一种提高亚油酸异构酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达亚油酸异构酶以提高该酶活性的方法。

背景技术

共轭亚油酸是由必需脂肪酸亚油酸衍生的共轭不饱和双键位于不同位置的18碳共轭双烯酸几何异构体的总称。许多微生物能利用自身的亚油酸异构酶将亚油酸转化成共轭亚油酸。但目前应用的亚油酸异构酶主要存在以下问题：酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达。细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率。分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。

本发明开发一种将亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高亚油酸异构酶活性。

发明内容

针对现有的亚油酸异构酶催化效率低的问题，本发明提供一种将亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物完全接触，从而显著提高亚油酸异构酶活性。

本发明的一种提高亚油酸异构酶活性的方法，包括以下步骤：将亚油酸异构酶基因(Genbank号：DQ227322)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号：M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号：AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+亚油酸异构酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。

将包含上述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有3.5％(重量百分比)半乳糖和4-7.5％乳糖(重量百分比)的YPD培养基中。

本发明的优点：

将亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高亚油酸异构酶活性。

具体实施方式

以下通过实施例进一步对本发明进行描述：

本发明开发一种将亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高亚油酸异构酶活性。

三种酶分子表达方式如下：

-：酶分子

细胞内表达        分泌表达        展露表达

实施例1亚油酸异构酶展露表达

将亚油酸异构酶基因(来自Lactobacillus plantarum，Genbank号：DQ227322)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(来自酿酒酵母表达载体pYES263，Genbank号：AY428072)下游MFα1信号肽序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框(从N端到C端)：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+亚油酸异构酶基因+α凝集素。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)，则MFα1信号肽将引导亚油酸异构酶向酿酒酵母细胞外分泌，而亚油酸异构酶下游的α凝集素则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使亚油酸异构酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。

实施例2亚油酸异构酶展露表达的诱导

在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加3.5％半乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & ServicesCo.，Ltd.)和4-7.5％乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology & Services Co.，Ltd.)，则表达框“GAL1启动子+MFα1信号肽序列+亚油酸异构酶基因+α凝集素”中的GAL1启动子就会活化，诱导亚油酸异构酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。

实施例3半乳糖和乳糖对亚油酸异构酶展露表达的作用