[发明专利]草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白原核表达载体构建及多克隆抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及到生物基因克隆表达技术领域，特别涉及到草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)原核表达载体构建及多克隆抗体的制备方法。

背景技术

草鱼出血病是我国淡水鱼类中传染性高、致死性的病毒性鱼病，其病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)。自从1979年Meyers分离出第一株水产类病毒以来，已有60多种水产类病毒被证实，其中很多病毒不会引起大规模发病或对水产养殖影响较小，而GCRV被认为是致病性最高的水产类病毒。因此GCRV可以作为研究水产类病毒复制和发病机理的模型，这对研究水产类病毒性疾病有重大意义。

草鱼呼肠孤病毒为水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，ARV)，呈二十面体对称的球形，其基因组由11条分段的dsRNA片段组成。由于水生呼肠孤病毒至今尚未建立标准血清型，目前该属亚型的划分是以RNA：RNA杂交为依据进行归类。ARV分为七个亚型(A-G)，G亚型代表草鱼呼肠孤病毒。草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)分子量约为34KD，含1个锌指序列调节基因表达。该蛋白具有协同其他蛋白通过构象变化行使膜穿透功能，还可能在病毒识别和进入宿主细胞的过程中起着识别接受器的作用。

发明内容

本发明的目的是将草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因克隆至原核表达质粒中，并在大肠杆菌中大量表达和纯化，经免疫小鼠，以得到特异性好，浓度高的抗体，从而能大量制备出廉价的、高质量的抗草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)的抗体。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案为：

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)原核表达载体构建及多克隆抗体制备方法至少包括：病毒RNA提取、PCR扩增、酶切、连接、草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因测序及原核表达载体构建、感受态细胞的制备与重组质粒的转换、重组克隆的筛选及酶切鉴定。

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白原核表达载体构建及多克隆抗体制备方法的具体步骤如下：

1、用Trizol提取感染过草鱼呼肠孤病毒的CIK细胞总RNA；

2、通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，并回收产物；

3、将pET-32a(+)质粒和回收产物双酶切，分别回收pET-32a(+)载体片段和草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因片段；

4、将pET-32a(+)载体片段和草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因片段于16～25℃过夜连接；

5、用连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞；

6、从LB琼脂平板上挑取菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，28～37℃震荡培养过夜，使用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，对重组质粒分别进行酶切鉴定和PCR鉴定；

7、将转化过重组质粒的BL21涂布于LB固体平板，37℃培养过夜，菌落PCR鉴定阳性克隆。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，28～37℃200r/min1摇菌培养过夜，按1∶100比例接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，28～37℃200r/min至OD₆₀₀值达到0.5，在28～42℃条件下，使用不同IPTG浓度(0.1～2mol/L)和不同的诱导时间(1～24h)进行诱导表达；

8、将诱导过的重组菌株于4℃4000r/min离心5分钟，取上清12000r/min离心20-60分钟，弃上清，将两次离心沉淀用100～200μl PBS悬浮，重悬浮液中加入SDS-PAGE上样缓冲液100～200ul(含β巯基乙醇)，煮沸5～10分钟后取10μl进行SDS-PAGE；

9、纯化重组蛋白；

10、将重组蛋白、CpG-2006、氢氧化铝混匀配制疫苗，经腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠，20天后加强免疫，取重组蛋白稀释于碳酸缓冲液，包被抗原，经封闭后将Balb/c小鼠血清(尾静脉采血)依次加入板中，设1阴性血清对照，孵育，用含吐温20的PBS洗，加入酶标二抗，孵育，PBS洗，加入OPD，待充分显色后加入2M硫酸终止，置于酶标仪读取结果(OD₄₉₂)。

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白原核表达载体构建及多克隆抗体制备方法的具体步骤中的步骤2中PCR反应条件为：

1、95℃预变性5分钟；

2、94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟为一个循环，共进行30个循环；

3、72℃延伸8-10分钟。

本发明的积极效果为：