[发明专利]环介导恒温扩增技术快速检测微小原甲藻的方法无效
| 申请号： | 201010173306.9 | 申请日： | 2010-05-12 |
| 公开（公告）号： | CN101942506A | 公开（公告）日： | 2011-01-12 |
| 发明（设计）人： | 张凤英;马凌波;徐兆礼 | 申请（专利权）人： | 中国水产科学研究院东海水产研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所 31233 | 代理人： | 黄志达;谢文凯 |
| 地址： | 200090 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 环介导 恒温 扩增 技术 快速 检测 微小 原甲藻 方法 | ||
1.一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，包括：
(1)赤潮藻类的基因组DNA提取
(2)LAMP扩增引物
两个外引物：
Pm-F3：5’-CGCGCTTGATCGTCTCTT-3’
Pm-B3：5’-CCAGTGGCAAGCCAAGAC-3’；
两个内引物：
Pm-FIP：5’-ACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG-3’
Pm-BIP：5’-TGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGA
CA-3’；
(3)LAMP扩增反应体系
(4)LAMP扩增产物的检测。
2.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为：2.5uL 10×buffer，两个内引物Pm-FIP和Pm-BIP的终浓度均为1.6μM，两个外引物Pm-F3和Pm-B3的终浓度均为0.2μM，另外包括6mM MgSO4，0.6mM dNTP，0.6M Betaine(Sigma-Aldrich)，8U Bst DNA聚合酶，1uL DNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的条件为：反应温度65℃，反应时间60min，最后于85℃保持3min终止反应。
4.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增技术快速检微小原甲藻的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，电泳检测可见阳性反应出现梯状条带，阴性反应没有条带的出现，肉眼观察可见阳性反应管内有大量白色沉淀产生，或加2μL100×SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变的为阴性。
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