[发明专利]环介导恒温扩增技术快速检测短凯伦藻的方法

说明书

技术领域

本发明属短凯伦藻的DNA分子检测领域，特别是涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测短凯伦藻的方法。

背景技术

短凯伦藻(Karenia brevis)是世界范围内海域多发赤潮藻，近年来在全球多个海域引发赤潮。对赤潮进行预测首要问题是对赤潮藻类进行检测，传统的藻类鉴定是通过形态学的观察来划分的，从色素，色素体，贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，这是一件费时费力的事，而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难以胜任这项工作，并且环境对藻类形态有很大影响，鉴定到种存在的困难较多。

目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)技术发明以来，这种技术就被应用到诸多领域。许多学者通过微藻某些基因片段扩增来对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析，核糖体间隔区(ITS)的PCR扩增和测序，从而完成对微藻的种类鉴定。荧光原位杂交也是近年来微藻鉴定的检测手段，有些学者利用核糖体大亚基(LSU)和ITS区分子探针对某些赤潮微藻进行了鉴定，但是这种技术对探针要求高，而且定量效果差。实时荧光定量PCR检测也是近年来微藻检测一个方向，这种方法非常灵敏，所需时间也不长(大概1～2小时)，但是所需实验仪器(荧光定量PCR仪)和试剂价格昂贵。上述方法因为实验条件等因素限制不能应用于现场检测。环介导恒温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种快速检测DNA的方法。利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定。

这种技术已经广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。但迄今为止，尚未见将该技术应用于短凯伦藻的检测鉴别的相关文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种环介导恒温扩增技术快速检测短凯伦藻的方法，该方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对短凯伦藻快速鉴定和现场检测。

本发明的一种环介导恒温扩增技术快速检短凯伦藻的方法，包括：

(1)赤潮藻类的基因组DNA提取

(2)LAMP扩增引物

(3)LAMP扩增反应体系

(4)LAMP扩增产物的检测。

所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为：2.5uL 10×buffer(内含2mM的MgSO4)，2个内引物Kb-2FIP1和Kb-2BIP1的终浓度均为1.6μM，两个外引物Kb-2F31和1Kb-2B31的终浓度均为0.2μM，其他还包括6mM MgSO4，0.6mM dNTP，0.6M Betaine(Sigma-Aldrich)，8U Bst DNA聚合酶，1uL DNA模板(50ng)；

所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的反应条件为：反应温度为65℃，反应时间为60min，最后于85℃保持3min终止反应；

所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，反应管内可见到大量白色沉淀产生则呈阳性；或加2μL 100×SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变(橙色)为阴性。

有益效果

本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速(1小时内即可完成检测)、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对短凯伦藻快速鉴定和检测，有望应用到赤潮现场快速检测领域。

附图说明

图1为短凯伦藻LAMP电泳检测图；

图2为短凯伦藻LAMP检测SYBR Green I染色检测图；

其中，1.短凯伦藻；2.米氏凯伦藻；3.环状异帽藻；4.赤潮异湾藻；5.卡氏前沟藻；6.利玛原甲藻；7.角毛藻；8.链状亚历山大藻。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1