[发明专利]胃泌素释放肽导向融合蛋白

说明书

一.技术领域

目前治疗癌症有许多手段，其中包括手术、放疗和化疗等，手术是非常有效的一种手段，但受到病种和病程的限制，很多情况下都无法应用，放化疗是治疗癌症最常见的手段，但其副作用很大，效果不尽如人意，所以人们试图找出一种副作用小并且高效的生物治疗方法来替代放化疗法。

本发明涉及到一种融合蛋白，以胃泌素释放肽为融合蛋白导向部分，能够特异性地与过量表达胃泌素释放肽受体的肿瘤细胞相结合，以假单胞杆菌外毒素A的缺失体PE40，并且其C末端5个氨基酸突变为Lys-Asp-Glu-Leu，即为PE40KDEL作为融合蛋白效应部分，特异性地杀死肿瘤细胞。

二.背景技术

1.本项目融合蛋白的导向部分：胃泌素释放肽(GRP)：

胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide，GRP)是蛙皮素样肽的同系物.，是一种胃肠道激素的有效的促分泌素或调节肽，是正常人脑、胃的神经纤维以及胎儿肺的神经内分泌组织中存在的激素，许多小细胞肺癌细胞株和肿瘤组织中也分泌GRP，且富含GRP受体(GRPR)。(胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在肿瘤研究中的应用。中国药物与临床，2007年11期，828-831)

目前的研究表明，胃泌素释放肽受体在许多人类肿瘤细胞中产生高表达，如肺癌、消化道癌和妇科癌中，胃泌素释放肽受体属于G蛋白藕联受体，其在肿瘤组织中过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、发展和浸润等方面发挥了重要作用。(胃泌素释放肽受体在妇科肿瘤中的研究进展。国际生殖健康/计划生育杂志，2010，V29(1)：828-831)

2.本项目融合蛋白的毒素部分：PE40KDEL

假单胞杆菌外毒素A(PEA)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面的PEA受体结合进入细胞，催化延长因子2(EF-2)的ADP核糖基化，阻止蛋白质合成，而导致细胞死亡。PEA分子由3个部分组成，包括受体结合结构域、转位(跨膜)结构域和活性结构域。为了消除PEA与细胞的非特异性结合，我们将PEA分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端1-252位氨基酸后，得到了PE40分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变，突变为Lys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDEL。

3.导向部分与毒素部分的连接：

通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为：导向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40KDEL)，融合蛋白序列见SEQ ID NO1。

4.本发明融合蛋白的特点：

基于前面所述，胃泌素释放肽受体在许多人类肿瘤细胞中产生高表达，如肺癌、消化道癌和妇科癌中，其在肿瘤组织中过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、发展和浸润等方面发挥了重要作用。所以目前有很多报道是针对胃泌素受体进行肿瘤治疗的，包括使用GRP的类似物与紫杉醇藕联，GRP与单链抗体相连，(胃泌素释放肽受体在肿瘤治疗中的研究进展。世界华人消化杂志，2009年，V17(1)：63-67)GRP与光标记或者金属螯合剂藕联(改进的胃泌素释放肽化合物。中国专利，申请号：200710188657.5)。

这些技术在针对肿瘤治疗存在了一定的局限性，比如，GRP与紫杉醇等化疗药相藕联，由于其藕联方式的问题，化疗药容易脱落，造成药物失效，并且化疗药由于不具有选择性，在整体药物到达肿瘤部位之前容易侵害正常细胞；其次，GRP与单链抗体相连，由于单链抗体的作用没有全抗体的作用强，所以其仅仅起到抑制肿瘤细胞的作用，而由于肿瘤细胞增殖的快速性，无法起到有效控制肿瘤的目的；GRP与光标记或者金属螯合剂藕联，目前主要是作为诊断来使用，作为治疗手段无法高效地杀死肿瘤细胞。

通过本发明有效地解决了上述各种方法的缺点，本发明是使用GRP作为导向，PE40KDEL作为毒素部分，能够高效地杀死肿瘤细胞。由于二者是通过5肽肽键进行相连，所以不会有药物脱落的问题；并且毒素部分只有在进入肿瘤细胞后，才能够发挥杀死细胞的作用，而正常细胞表面没有GRP受体或含量极低，所以其对于正常细胞的毒性非常小，而是特异性杀死肿瘤细胞，并且由于PE40KDEL杀死肿瘤细胞的高效率，作为治疗手段能够控制肿瘤的发展。本专利发明了一类新型导向药物，是选择GRP以及细胞毒素的小功能片段组成的融合蛋白导向药物，其具有分子量小，用量少和特异性强等特点。

三.发明内容