[发明专利]一种含凝血酶片段融合肽

说明书

一.技术领域

本发明涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508。本发明还涉及含有所述S-TP508的药物组合物。本发明还涉及所述S-TP508用于制备治疗皮肤组织损伤与角膜损伤药物的用途。本发明还涉及利用所述S-TP508治疗皮肤组织损伤与角膜损伤的疾病的方法。

二.发明背景

凝血酶是由凝血酶原(Porthormbin)转化而来的一种丝氨酸蛋白酶，在体内的主要作用是催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白，诱导血小板粘附、聚集和释放等反应，是血小板的强诱导剂，因而在血液凝固中起重要作用。现已证明，凝血酶除了其血液凝固作用外，还可刺激成纤维细胞、表皮细胞增生等，在促进创面愈合方面也起重要作用。

TP508(凝血酶受体激活肽)是取自人凝血酶原分子序列第508～530个氨基酸残基的片段，研究发现具有可特异性激活细胞表面的高亲合性凝血酶受体，刺激细胞分裂和趋化，参与组织修复，刺激细胞增生和促进创面愈合的功能。

由于TP508是只有23个氨基酸组成的短肽(见序列为SEQ ID NO：1中12-34位氨基酸序列)，所以半衰期短，稳定性差。因而我们在TP508的N端加上了一段稳定肽(见序列为SEQID NO：1中1-11位氨基酸序列)，这段稳定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸组成。加入稳定肽的该融合蛋白较之TP508延长了半衰期，提高了稳定性。作为运用于人体的药物，克服了TP508易被酸解的弱点，具有提高药效、降低病人服药量、延长有效期、减少成本等显著的社会和经济效益。

TP508分子量非常小，半衰期很短。本专利通过将一段具有稳定功能的短肽序列加到TP508的N端，显著的提高了半衰期，稳定性也大幅的提高。本专利对TP508进行改造主要有以下理由：(一)TP508分子量比较小，半衰期短可以较好地解决此处肽键酸解断裂的问题。(二)通过对融合肽的二级结构的模拟及根据相关文献资料报道，发现加上了稳定肽不会影响TP508其二级结构和三级结构的形成，即保证改造后TP508生物活性的稳定。

三.发明内容

本发明的一个方面，涉及一种凝血酶片段融合肽，其为SEQ ID NO：1所示的S-TP508。

作为本发明中的融合蛋白，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为稳定肽和TP508组成的融合蛋白，可以使用一种具有序列表中SEQ ID NO1的序列，也可以使用对序列表SEQ ID

NO1中融合蛋白的氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。换句话说，也可以使用采用其氨基酸序列大体上与序列表SEQ ID NO1中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90％序列同一性的变体或其功能性片段。

本领域普通技术人员知晓，所述S-TP508可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中，所述S-TP508是通过基因工程重组表达的方法获得的。

在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得S-TP508，包括如下步骤：

1)表达载体的构建

依据已知S-TP508氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成目的基因序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位点，得到S-TP508的核酸序列。再分别将如上述制备的目的基因序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。

用限制性酶切下目的基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本研究所质粒pGM(该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本研究所构建)连接，经筛选得到正确地重组子。

2)目的蛋白的表达及分离纯化

将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用蛋白酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98％的终产物。

本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的S-TP508，以及任选的药物上可接受的载体。

在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。