[发明专利]土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺

权利要求书

1.一种土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，包括以下步骤：

a.平板培养基的制备：首先选用加拿大产地的小麦，逐粒挑选粒大、饱满、无虫蛀及无霉变的小麦颗粒，粉碎为80目以上制备成全麦粉，再按照全麦粉3.5～4.5％、酵母浸膏粉0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.1～0.3％、琼脂1.5～2.5％、余量为水的比例配制平板培养基，将平板培养基经过灭菌倒入灭菌后的培养皿中；

b.单孢子悬液的制备：取预先选定的出发菌种，接种3～5只茄瓶斜面，培养出发斜面孢子，然后选取外观质量合格的出发斜面孢子制成单孢子悬液；

c.单菌落的培养：将单孢子悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-7、10-8、10-9；将以上三个浓度的单孢子悬液分别接种到不同培养皿的平板培养基上，在温度为36～37℃、相对湿度为40～50％的条件下培养；

d.单菌落孢子悬液的制备：选择菌落直径较大、白色、孢子丰满、边缘整齐的主型单个菌落，制成单菌落孢子悬液，分装在4只试管中，塞上棉塞、包好封口膜并编号；

e.单菌落冷冻菌的冻存：将装好单菌落孢子悬液的试管按照编号顺序摆放在铝制的试管架上，浸入-70℃丙酮中预冻，再迅速放入-70℃的超低温冰箱保藏；

f.摇瓶初筛和摇瓶复筛：取步骤e中单菌落冷冻菌中的其中2只试管，采用与生产相近的培养基和培养条件，进行单菌落冷冻菌的摇瓶初筛和摇瓶复筛，选出生产能力强的单菌落冷冻菌；

g.单菌落冷冻菌的制备：根据步骤f摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与生产能力强的单菌落冷冻菌编号对应的另外2只单菌落冷冻菌试管，制备生产用冻干管菌种。

2.按照权利要求1所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述平板培养基的制备，包括全麦粉的加工方法，该方法是选用加拿大产地的小麦，逐粒挑选粒大、饱满、无虫蛀及无霉变的小麦颗粒，粉碎为80目以上。

3.按照权利要求2所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述平板培养基的制备，平板培养基的配方是全麦粉4％、酵母浸膏粉0.2％、磷酸二氢钾0.2％、琼脂2％、余量为水。

4.按照权利要求3所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述平板培养基的制备，还包括平板培养基的灭菌方法，该方法是在0.1MPa、120～122℃的条件下灭菌30分钟，灭菌结束后保压降温。

5.按照权利要求1、2、3或4所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述的单菌落的培养是在恒温室或生化培养箱内进行，培养1天后将培养皿翻转培养，培养温度36.5℃、相对湿度42～48％、培养周期5天。

6.按照权利要求1、2、3或4所述土霉素单菌落冷冻菌的制备工艺，其特征在于：所述的单菌落孢子悬液的制备过程是用接种环挑下选择的主型单个菌落，放入预先加有灭菌玻璃珠的规格为18×180mm的试管中，振荡打下孢子，再加2ml的10％甘油保护剂，摇动制成单菌落孢子悬液，用0.5ml灭菌移液管将悬液分别吸入4只规格为12×120mm的试管中，平均每只约装0.5ml。