[发明专利]二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体及其制备方法无效
| 申请号： | 201010173918.8 | 申请日： | 2010-05-17 |
| 公开（公告）号： | CN101899115A | 公开（公告）日： | 2010-12-01 |
| 发明（设计）人： | 杨纯正;熊冬生;李崴;任思楣;程昕;师锐赞;刘荣 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院血液学研究所 |
| 主分类号： | C07K16/28 | 分类号： | C07K16/28;C12N15/62;C12N15/13;C12N15/70 |
| 代理公司： | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人： | 江增俊 |
| 地址： | 300020 *** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 二硫键 稳定 cd3 cd19 微型 功能 抗体 及其 制备 方法 | ||
1.一种二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体，其特征在于：以抗CD3-抗CD19抗体为基础，在抗CD3VL第100位氨基酸Ser和抗CD3VH第44位氨基酸Gly引入氨基酸Cys突变，表达后产物具有由序列3，序列4所示的抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位的半胱氨酸形成的二硫键连接的结构。
2.根据权利要求1所述的二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体，其特征在于：所述氨基酸Cys突变在抗CD3鼠源性单克隆抗体HIT3a的轻重链可变区。
3.根据权利要求1所述的二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体，其特征在于：所述表达后产物的分子量为55kDa。
4.一种如权利要求1所述的二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：
(1)运用PCR和overlap PCR法在抗CD3VL第100位氨基酸Ser和抗CD3VH第44位氨基酸Gly引入氨基酸Cys突变，得到2个突变序列；
(2)将上述序列克隆到中间载体pB11d1-100和pBYZ11d2-44中，经酶切、验证得到抗CD3VL-抗CD19VH和抗CD19VL-抗CD3VH基因片段；
(3)将步骤(2)得到的两个基因片段融合到大肠杆菌表达质粒pAYZ-dsCD3CD19中，然后将质粒pAYZ-dsCD3CD19转化到感受态大肠杆菌16C9中，进行培养、酶切及测序验证表达载体构建成功；
(4)将步骤(3)经验证质粒pAYZ-dsCD3CD19构建成功的单菌落进行培养，培养后进行细菌的裂解和粗提，得到粗提物；
(5)对步骤(4)获得的粗提物进行纯化和鉴定，得到二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体。
5.根据权利要求4所述的二硫键稳定的抗CD3-抗CD19微型双功能抗体的制备方法，其特征在于：所述单菌落的培养过程如下：
(1)将单菌落接种到含0.1mg/mL氨苄青霉素的2YT培养基中，37℃振荡培养8h；
(2)按1∶2的比例转接于含0.1mg/mL氨苄青霉素的Ap5培养基28℃振荡培养28h，4℃，2500×g离心收集菌体。
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