[发明专利]一种检测乙型肝炎病毒的试剂盒

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测乙型肝炎病毒DNA或RNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。

二、背景技术

对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr.Kary B.Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr.Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。

2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了LAMP技术的实际应用。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)简称乙肝病毒，是指引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，也称丹氏颗粒，简称HBV。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，为部分双链环状DNA。HBV的抵抗力较强。我国的乙肝病毒感染率约60％-70％；乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18％，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中乙肝患者大约有3000万。目前针对乙型肝炎病毒缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。

三、发明内容

本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测乙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，从而判定乙型肝炎病毒的存在与否。本发明试剂盒结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、成本低廉、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的乙型肝炎病毒病毒检测。

本发明试剂盒包括两部分：

1.标记有可以识别乙型肝炎病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；

2.可以扩增待检测样品中的乙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的乙型肝炎病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

该试剂盒的工作原理为：

1.纳米金颗粒标记有能识别乙型肝炎病毒特定序列的分子探针，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。

2.待检测样品中的乙型肝炎病毒DNA分子或乙型肝炎病毒RNA经环介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，乙型肝炎病毒的目标片段被放大10⁹倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。

3.混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，乙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别乙型肝炎病毒特定序列的分子探针杂交。

4.纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体(如附图所示)，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有乙型肝炎病毒DNA或RNA。

四、附图说明

标记有分子探针的纳米金颗粒与乙型肝炎病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA杂交示意图，纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体。

五、具体实施方式

本发明试剂盒包括2管溶液，一管中是标记有可以识别乙型肝炎病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒溶液50μl，一管中是250μl可以扩增待检测样品中的乙型肝炎病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的乙型肝炎病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

纳米金颗粒溶液中含有直径为20nm的纳米金颗粒，浓度为1.2nM，纳米金颗粒表面标记有巯基修饰的DNA探针。