[发明专利]利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法

说明书

技术领域

本发明属海水细菌分离培养领域，特别是涉及一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法。

背景技术

地球上辽阔的海域孕育了丰富的海洋微生物。海洋面积达3.6×10⁸km²，约占地球表面积的71％，占地球总水量的97％，是地球上最大的水体地理单元。浩瀚的海洋是生命的摇篮，据统计，在海洋中发现并命名的生物大约有30万种，约占地球物种的80％，其中微生物种类有百万种以上，而目前所研究和鉴定过的海洋微生物仅占所有海洋微生物种类的5％。独特的海洋环境蕴藏着丰富的微生物资源，海洋微生物的生物多样性和所处环境的异质性决定了其代谢产物多样性，为人类提供了种类繁多，分子结构新颖，化学组成复杂和生理活性特异的天然活性产物。调查海洋微生物资源是开发微生物资源的前提和基础。海洋微生物培养则是通过培养基，把海水和海洋沉积物中的细菌分离培养出来，然后再进行研究以达到开发利用海洋微生物资源的目的。由于海洋微生物的多样性，对分离培养的要求比较高，如何建立一种充分又全面地分离海洋微生物的方法，是大家研究的热点。

目前，最常用的分离海水细菌的方法就是直接涂布法，即取定量的海水用涂布棒直接涂布在培养基上，这种方法的缺点是：由于海水中的含菌量非常小，用这种方法很难把海水中所有的细菌都分离培养出来，达不到充分的分离培养海洋微生物的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，该方法可以克服因海水中所含菌量少，难以培养的缺点，通过先富集细菌再培养，使海水中的大部分细菌可以分离培养出来，为全面研究海水中的细菌提供了可能，具有重要的实际应用意义。

本发明的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，包括：

(1)注射器、针头式过滤器灭菌

将注射器、针头式过滤器分别用纸包好，进行高压灭菌；

(2)在过滤器中放入无菌纤维素滤膜

将滤膜经预处理后装入上述针头式过滤器中，滤膜和过滤器接触面充分贴合，不留缝隙，防止过滤时周围漏液，一个过滤器放入一张滤膜；

(3)过滤富集海水细菌

先用注射器吸取海水，然后通过针头式过滤器，在无菌纤维素滤膜上富集海水细菌；

(4)培养海水细菌

将富集了海水细菌的纤维素滤膜置于佐贝尔培养基上，纤维素滤膜与培养基的接触面充分贴合，使滤膜上的细菌能充分吸收营养生长，进行海水细菌的培养。

所述步骤(1)中的注射器的型号为10毫升的塑料注射器，针头式过滤器的型号是SwinnexPP可换膜针头式过滤器(过滤器中可装入直径为25mm的滤膜)。

所述步骤(1)中的高压灭菌的条件为温度121℃，时间30min。

所述步骤(2)中的滤膜预处理是指将无菌纤维素滤膜用70℃的蒸馏水浸泡，使其全部湿润，4h后倒去水，再用70℃的蒸馏水浸泡过夜，使用前再用40℃蒸馏水浸泡清洗一次。所述步骤(2)中的无菌纤维素滤膜的孔径为0.45um。

所述步骤(3)中的海水取自东海东经120°到123°，北纬28°到31°的海域。

所述步骤(5)中的佐贝尔(ZoBell)培养基的配方是蛋白胨5g，琼脂15g，酵母膏1g，FePO40.01g，人工海水1000ml，培养基pH值为7.6～7.8，培养基于121℃高压灭菌20min。所述的人工海水配方如下：NaCl 23.476g，MgCl₂·6H₂O 10.6359g，Na₂SO₄3.917g，CaCl₂1.102g，KCl 0.664g，NaHCO₃0.192g，KBr 0.096g，H₃BO₃0.026g，SrCl₂·6H₂O 0.0403g，NaF 0.072g，NaNO₃0.050g，NaH₂PO₄0.005g，Na₂SiO₃·9H₂O 0.010g，MnCl₂·4H₂O 0.0003g，FeC₆H₅O₇·3H₂O 0.00054g，蒸馏水1000ml。

有益效果