[发明专利]海洋甲壳类动物支原体培养基及分离纯化方法

权利要求书

1.一种海洋甲壳类动物支原体培养基，包括液体培养基和固体培养基，其特征在于：

将

支原体肉汤培养基      12.0～15.0g

0.4-1wt％苯酚红       2.35～3.00mL

重蒸水                470～600mL

在pH为7.0-8.0、110℃-121℃的条件下灭菌10-20min，冷却至50-60℃后加入5-30mL小牛血清在56℃灭活30min，然后再加入10-40v％新鲜酵母浸出液5-20mL、5-10wt％葡萄糖溶液0.5-3mL、5-15wt％醋酸铊水溶液0.1-0.5mL和5-20mg/mL青霉素0.5-2mL混合均匀得到所述的液体培养基；

将

支原体肉汤培养基    12.0～15.0g

重蒸水              470～600mL

琼脂粉              0.94～1.2wt％

在pH7.0-8.0、110℃-121℃条件下灭菌10-20min，待冷却至55～60℃后，加入已过滤除菌的小牛血清5-30mL、10-40v％新鲜酵母浸出液5-20mL、5-15wt％醋酸铊水溶液0.1-0.5mL和5-15mg/mL青霉素0.5-2mL，混合均匀后将混合液倾注到灭菌平板上制成固体培养基；

其中，所述新鲜酵母浸出液的制备方法如下：

称取高活性干活酵母，悬浮于2-6倍的蒸馏水中，在20-40℃搅拌5-30min后，在室温下发酵15-60min，然后加热至沸点，冷却得到发酵液；将发酵液以2000-4000rpm离心15-30min，取上清液，用NaOH调pH值至7.0～8.0，然后将上清液置于90～95℃水浴中10-20min；冷却后，再以7000～8000rpm离心15-30min，取上清液用0.22-0.45μm膜过滤除菌即得到新鲜的酵母浸出液。

2.一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤：

1)无菌剪取病样器官，加3～6倍病样器官体积的支原体肉汤培养基及0.5-1倍病样器官体积的石英砂，无菌研磨成乳剂，3000-5000rpm离心10-20min，将上清液经0.22-0.45μm膜无菌过滤，除去杂菌，得到无菌上清液；

2)取无菌上清液接种于10倍体积所述的液体培养基中，置于22-41℃、浓度为5％～10v％的二氧化碳培养箱中培养，48-72h盲传，将盲传代接种到所述的固体培养基上，置于22-41℃、浓度为5％～10v％的二氧化碳培养箱中培养，进行菌落生长，得到特征菌落；

3)将所述的特征菌落再接种到所述的液体培养基上培养生长，将得到的培养物接种到所述固体培养基上进行菌落生长；重复该步骤，直至得到所需支原体的特征菌落；

4)用无菌刀片挑取所述的特征菌落接种于所述的液体培养基，于22-41℃、50-100rpm震荡培养，至液体培养基颜色由红变黄时取出培养物；对该培养物与所述液体培养基进行10倍稀释法，稀释至所需浓度，得到稀释液；取0.1-1mL上述稀释液接种于固体培养基继续培养，分离出支原体特征病菌；

5)重复步骤4三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。

3.一种海洋甲壳类动物支原体的分离纯化方法，其特征在于包括下述步骤：

1)无菌剪取病样器官，加3～6倍病样器官体积的支原体肉汤培养基及0.5-1倍病样器官体积的石英砂，无菌研磨成乳剂，3000-5000rpm离心10-20min，将上清液经0.22-0.45μm无菌滤器过滤，除去杂菌，得到无菌上清液；

2)取0.2-1mL无菌上清液涂布于所述的固体培养基上，22-41℃下置于二氧化碳培养箱的潮湿环境中培养，CO₂浓度范围为5％～10v％，培养3～5天，得到支原体特征菌落；用无菌刀片选取所述的特征菌落接种于液体培养基，在22-41℃、50-100rpm条件下震荡培养，至液体培养基的颜色变黄时得到培养物；向该培养物中加入所述的液体培养基进行10倍稀释法，得到所需浓度的稀释液；将该稀释液接种至所述固体培养基继续培养，分离出支原体特征菌落；

3)对得到的特征菌落重复步骤2三次以上，得到纯化的海洋甲壳类支原体。