[发明专利]三苯基甲烷类染料脱色酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种三苯基甲烷类染料脱色酶及其应用。

背景技术

三苯基甲烷染料包括碱性、酸性、溶剂染料等，广泛应用于纺织印染、医药、生物染色、造纸等领域。由于其生物毒性及致癌、致畸、致突变的三致性对人类健康构成威胁，引起了广泛的关注。孔雀石绿是三苯基甲烷类染料中的一种代表，它是一种工业染料，又是一种杀真菌剂，对鱼类水霉病、原虫病等的控制非常有效，因此，长期以来孔雀石绿在水产养殖业中的使用极为普遍。

生物方法是目前去除染料污染较为有效的方法，具有无毒、无残留、无二次污染的优势。将固定化脱色酶应用于含染料废水的脱色及循环利用时，无需添加供菌体生长的底物，因而具有美好的应用潜力。现在已有将固定化的偶氮还原酶应用于含偶氮染料的印染废水处理的相关报道。目前，国内外研究者已发现多种可降解三苯基甲烷类染料的脱色酶及并对相关基因进行了研究。真菌中的木质素酶系、真菌和分枝杆菌中的细胞色素P450单加氧酶、柠檬酸杆菌中的三苯基甲烷类染料还原酶TMR、嗜水气单胞菌中的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD等脱色酶及各种脱色基因已成为研究热点。真菌中的Phanerochaete chrysosporium能够利用其木质素过氧化物酶以逐步去甲基化的方式对三苯基甲烷染料结晶紫进行脱色与降解；Cunninghamella elegans通过细胞中某种未知酶的作用以去甲基化的方式对孔雀石绿进行脱色与降解，且有P450系统的参与。而细菌中催化三苯基甲烷类染料脱色的关键酶(或酶系)到目前为止仍不清楚。

深入研究细菌中三苯基甲烷类染料脱色酶并探讨其脱色的酶学特性和机制，可以利用基因工程技术将脱色酶转化或转移到特定的载体中，进行高效表达，从而为利用固定化脱色酶处理工业废水的工艺设计提供科学参考，在该领域具有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高活力的三苯基甲烷类染料脱色酶。

本发明还要解决的技术问题是提供表达上述三苯基甲烷类染料脱色酶的基因。

本发明还要解决的技术问题是提供上述三苯基甲烷类染料脱色酶的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种三苯基甲烷类染料脱色酶(即二氢嘧啶酶TDE)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，它包含了479个氨基酸。

表达上述三苯基甲烷类染料脱色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，它包含了1440bp的碱基。

上述三苯基甲烷类染料脱色酶的纯化方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)硫酸铵沉淀：

(1a)将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440于LB培养基中培养，离心收集菌体，超声破碎后离心取上清液；

(1b)将步骤(1a)得到的上清液进行硫酸铵沉淀，即在磁力搅拌器上不断搅拌条件下，缓慢加入硫酸铵固体至一定饱和度，继续搅拌30min，离心收集在40～50％的硫酸铵饱和浓度段得到的蛋白沉淀，将得到蛋白沉淀重溶于pH 8.0、20mM Tris-HCl中，再透析去除蛋白溶液中的硫酸铵；

(2)阴离子交换：

(2a)DEAE阴离子交换柱用pH 8.0、20mM Tris-HCl平衡后，将步骤(1b)透析后得到的蛋白溶液过DEAE阴离子交换柱，用pH 8.0、20mM Tris-HCl冲洗直至蛋白检测器在A₂₈₀处为0.05，流速为1.0ml·min^-1；

(2b)将DEAE阴离子交换柱用0～0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1.0ml·min^-1，收集浓缩0.23～0.26M NaCl洗脱范围内得到的蛋白溶液，重溶于pH 8.0、20mMTris-HCl中，再透析除去蛋白溶液中的NaCl；

(3)凝胶过滤层析：

(3a)凝胶过滤层析柱用pH 8.0、20mM Tris-HCl平衡后，将步骤(2b)透析后得到的蛋白溶液过凝胶过滤层析柱，流速为0.5ml·min^-1，蛋白检测器在A₂₈₀处有蛋白吸收峰的位置，以2ml为单位收集蛋白溶液，以孔雀石绿为底物，测定所收集各蛋白溶液的酶活，根据酶活强弱，收集得到具有脱色活性的过柱后蛋白溶液；

(3b)将步骤(3a)中得到的具有脱色活性的蛋白溶液各取15～20μl分别进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，根据电泳谱带结果，选择电泳图谱简单(即电泳条带较单一)对应的具有脱色活性的蛋白溶液，合并，超滤浓缩。