[发明专利]一种利用三聚氰胺衍生物制备三聚氰胺高效价抗体方法的建立

说明书

技术领域

本发明涉及一种小分子的抗原、抗体制备方法的建立。

背景技术

小分子化合物，在组织化学上被称为半抗原，仅具有与相应抗体或致敏淋巴细胞的免疫反应性，而无免疫原性。对于半抗原的检测一般采用气相色谱、高压液相色谱、质谱等手段，但是免疫学检测方法在半抗原的检测上逐渐显示出其不可替代的优势。免疫学检测法不像传统的色谱和质谱等方法那样需要复杂、昂贵的设备，此外还具有易操作，前处理过程简单，成本低，检测快速、准确、灵敏，可实现高通量、自动化检测等优点，因此具有极为广泛的应用前景。

本发明中的三聚氰胺(Melamine)(化学式：C₃H₆N₆)，俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为[1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基]，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水(3.1g/L常温)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。

食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用一种叫做凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺(含氮量66％)与蛋白质(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象，从而造成诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等严重的食物安全事故。

中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，故暂未设定像农药般的残留标准限制。10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。中国卫生部2010年4月22日公布66项新乳品安全国家标准，包括乳品产品标准15项、生产规范2项、检验方法标准49项。其中，新的乳品安全国家标准中不再设置三聚氰胺相关规定。“不再设置三聚氰胺相关规定”，也就是说，三聚氰胺不再具备“合法”身份被“限量添加”到乳品制品中去。

三聚氰胺属于小分子化合物，与其他很多小分子化合物一样，一般采用GC、MS、LC-UV法、高效液相色谱法等测定三聚氰胺含量，相关检测机构建立的方法也少有报道。农业部标准NY/T 1372-2007中建立的饲料中三聚氰胺的测定方法是HPLC法和GC-MS法。最近国家质检总局与国家标准化管理委员会联合发布的《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T 22388-2008)中也是采用HPLC法、LC-MS/MS法、GC-MS和GC-MS/MS法。但以上方法存在过程冗长、需要衍生、试剂用量较大及灵敏度低等缺点而难以推广。

目前三聚氰胺免疫学检测方法也有报道，市面上也已经出现许多三聚氰胺的酶联免疫(ELISA)试剂盒。但是这些ELISA试剂盒的灵敏度普遍偏低，已经远远不能满足新出台的“新的乳品安全国家标准中不再设置三聚氰胺相关规定”的国家法规。因此高灵敏度的ELISA试剂盒的开发成为当务之急。

在高灵敏度ELISA试剂盒的开发中，获得高效价、高亲和力抗体是最重要的先决条件之一。根据我们对三聚氰胺的理化性质分析及实际的实验过程分析总结三聚氰胺的疏水性对于载体蛋白的偶联造成了非常大的困难，因为三聚氰胺为脂溶性，而载体蛋白为水溶性，只能通过“间相相转移催化”进行偶联，另外三聚氰胺具备三个相同的氨基，直接的偶联将会影响三聚氰胺的空间结构，目前常规的方法是采取先封闭部分氨基后再进行偶联，该方法的缺点也同样存在操作难度大，不好控制的缺点使得最终获得的抗体效价不高。

基于上述存在的问题，我们通过化学方法合成不改变三聚氰胺免疫原性但可以优化三聚氰胺溶解度等理化性质的化合物通过较为常用简单的EDC法偶联载体蛋白作为免疫原进而免疫动物获得针对于三聚氰胺的高效价抗体。并可通过该抗体进行三聚氰胺ELISA试剂盒、三聚氰胺免疫组化试剂盒、三聚氰胺化学发光法等的开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用三聚氰胺衍生物制备三聚氰胺高效价抗体方法的建立。