[发明专利]L6细胞模型在评价改善胰岛素抵抗药物或食品中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及降血糖功能性食品细胞评价模型的一种新用途，具体来说是指该细胞模型在评价具有改善胰岛素抵抗的药物或食品的用途，属医药和食品保健领域。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌代谢失常性疾病，具有并发症多、发病率较高的特点，现已成为仅次于肿瘤和心血管疾病之后的第三大非传染性疾病。我国学者提出糖尿病治疗五套马车的原则，其中饮食治疗应该是这套车的驾辕之马，饮食治疗对糖尿病控制最为重要，因此寻找有效地治疗糖尿病的新物质，特别是从天然资源中去筛选和研究降糖成分，已为国内外医药工作者所关注和瞩目。目前对糖尿病人有保健作用的食物资源，按照降血糖功能因子的不同有：黄酮类、萜类、多糖类、糖醇类、水溶性膳食纤维类、硫醚类、多肽类等有助于降血糖的物质资源，充分利用我国现有资源将为我国糖尿病的防治有所帮助。体内外模型是人类研究糖尿病、评价降血糖食品功效的重要手段，对此国内外研究人员已进行了大量工作，并取得了很大成绩。由于糖尿病发病机制复杂，目前还没有统一的糖尿病模型能够完全应用于降血糖食品功效的评价。探讨胰岛素抵抗发生的机制及改善胰岛素的物质的研究日益被人们所重视。但由于人体试验的局限性不便于对胰岛素抵抗的发生机制及其环节进行深入研究，因此，建立合适的体外细胞评价模型成为探讨胰岛素抵抗发生机制及评价降血糖功能因子已经成为国际上研究的热点。

发明内容

本发明的目的是，提供一种快速、简便、易于重复、价格低廉、便于控制的体外L6肌细

胞模型来评价药物或食品改善胰岛素抵抗的效果，为保健食品开发和功能评价提供一种新途径。

其中所述的改善胰岛素抵抗药物种类包括各种剂型的药品。

其中所述的改善胰岛素抵抗食品种类包括各种剂型的保健食品或食品。

本发明是发现了L6肌细胞模型在评价药品或食品改善胰岛素抵抗的作用，发明了该细胞体外模型作为评价改善胰岛素抵抗药物或食品效果的用途。

具体实施方案

以下通过细胞实验来阐明本发明所述体外模型的成功建立。

1材料与方法

1.1细胞、主要试剂

大鼠L6骨骼肌细胞株购自中国医学科学院细胞中心，[³H]标记的脱氧葡萄糖购自中国同位素公司。高糖DEME培养基、无糖无酚红DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。肿瘤坏死因子α(TNF-α)购自Peprotech公司，MTT、细胞松弛素B、胰岛素购自Sigma公司，葡萄糖，链霉素、青霉素，葡萄糖测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2细胞培养

用含10％FBS高糖DMEM培养基培养L6肌细胞，将制备好的L6细胞悬液用PBS洗涤2次，然后按3×10⁵细胞/每孔的浓度接种于6孔细胞培养板中，在5％CO₂、37℃饱和湿度条件下培养36h，形成单层贴壁细胞，当L6细胞聚合至70％的时候，换为含有2％FBS的DMEM培养基进行分化，每隔2天换液，直至细胞生长出肌管，用于实验。

1.3 L6肌细胞胰岛素抵抗模型的建立

采用TNF-α体外诱导培养法建立L6肌细胞胰岛素抵抗细胞模型。将6孔细胞培养板中已经分化好的肌细胞分为TNF-α诱导组和对照组，并设平行组用于判断试验过程中细胞活性。TNF-α诱导组每孔加入2ml新配制的含有10ng/ml鼠TNF-α的无血清无酚红培养液，对照组加入不含TNF-α的无血清无酚红培养液，继续培养24h。

1.4胰岛素抵抗L6细胞模型的鉴定

1.4.1葡萄糖消耗实验

采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)法。将上述细胞用PBS洗涤2次，加入含100ng/ml人胰岛素的培养液，5％CO₂、37℃饱和湿度条件下培养30min。加入葡萄糖5.6mmol/l，继续培养24h。分别于6、12、24h取培养液上清，用葡萄糖检测试剂GOD-POD法测定培养上清中的葡萄糖含量。试剂1(R1)与试剂2(R2)按4∶1比例混合配制成工作液，并平衡至测定温度，6孔板每孔取10μl培养上清入1.0ml工作液，同时设空白和标准管。混匀，37℃保温5～10min，于500nm处测各管吸光度。测定管与标准管吸光度对比可计算出培养液残存葡萄糖含量，单位为mmol/l。

1.4.2葡萄糖转运实验