[发明专利]重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体转移载体

权利要求书

1.重组火鸡疱疹病毒HVT细菌人工染色体BAC转移载体pUAB-gpt-BAC，其大小为16 100bp，HVT非必需区US2两侧同源臂A和B之间为8800bp，含黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因XGPRT，简称gpt基因，gpt基因表达盒Egpt的核心序列为BAC-gpt，具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性。

2.根据权利要求1所述的转移载体pUAB-gpt-BAC，是通过分子设计构建的，具体包括：

第一步：根据GenBank登录号：AF291866的HVT Fc126株基因组序列、GenBank登录号：X00221.1的gpt基因序列和GenBank登录号：U55763.1的质粒pEGFP-C1序列设计了以下PCR扩增引物：

引物     序列(5’-3’)                                酶切位点

gpt-F    GCGCTAGCGTCATGAGCGAAAAATACATCG               Nhe I

gpt-R    ACTGGATCCTTAGCGACCGGAGATTGGCG                BamH I

Egpt-F   GCGAATTCTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG      EcoR I

Egpt-R   GCGTCGACCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGA         Sal I

A-F      CGGGATCCACATCGGGCCACGTTCCGCC                 BamH I

         GCTCTAGAGCGTCGACCGGAATTCGATGAGCTGACGTGTGGA   XbaI、EcoR I

A-R

         GGAATTCAAGTCGACGGAAGCTTCCACTAATATGGGCACAC    EcoR I、Sal I、HindIII

B-F

         GCTCTAGATGGCCCATCTAGGTGATTAT                 Xba I

B-R

第二步：以E.coli DH5α染色体DNA为模板，用引物gpt-F、gpt-R扩增外源加压筛选标记基因gpt，用pMD18-T克隆载体克隆，获得含有gpt基因的阳性克隆质粒pMD-gpt；

第三步：用BamH I与Nhe I双酶切pEGFP-C1质粒，切除GFP基因，同时连接gpt片段，获得含有gpt基因的表达质粒pEgpt；然后，以pEgpt为模板，用引物Egpt-F、Egpt-R进行PCR扩增筛选标记基因gpt的表达盒Egpt，即CMV-gpt-poly A，与pMD18-T克隆载体连接，获得含有gpt基因表达盒Egpt的克隆质粒pMD-Egpt；

第四步：分别用引物A-F、A-R和B-F、B-R进行PCR，以HVT感染细胞总DNA为模板，分别扩增HVT左/右同源臂A/B，用pMD18-T载体克隆，分别获得含有HVT同源臂A和B的克隆质粒pMD-A和pMD-B；

第五步：将pMD-A用EcoR I和Xba I双酶切，pMD-B用EcoR I、Sca I和Xba I三酶切，回收pMD-A载体片段和同源臂B片段，T4 DNA连接酶连接，获得含有HVT左/右同源臂A/B的克隆质粒pUAB；

第六步：用EcoR I和Sal I分别双酶切pMD-Egpt和pUAB，回收gpt基因表达盒Egpt和pUAB载体片段，T4DNA连接酶连接，获得含有筛选标记基因gpt表达盒Egpt的克隆质粒pUAB-gpt；

第七步：用单拷贝BAC载体pIndigoBAC-5构建高拷贝BAC载体克隆质粒pUC18-BAC：

提取pUC18质粒，Hind III单酶切，回收pUC18目的片段，与BAC载体pIndigoBAC-5连接，电转化宿主菌DH10B，加入37℃的SOC培养基，并将其转移到1.5mL无菌Eppendorf管中，37℃、220r/min振荡培养1h，4000r/min离心5min，将细菌沉淀涂布于含氯霉素34μg/mL和氨苄青霉素100μg/mL的双抗LB培养基平板上，挑取克隆，摇菌16h后提取质粒，获得高拷贝BAC克隆质粒pUC18-BAC，其中SOC培养基为LB中含有0.2mmol/L葡萄糖，0.1mmol/L MgSO4和0.1mmol/L MgCl₂；

第八步：将pUC18-BAC与pUAB-gpt分别用Hind III酶切，回收pUAB-gpt线性化片段和BAC载体的基本功能基因，T4DNA连接酶连接，获得重组火鸡疱疹病毒细菌人工染色体HVT-BAC转移载体pUAB-gpt-BAC。

3.权利要求1或2所述转移载体pUAB-gpt-BAC在制备重组HVT活病毒载体基因工程疫苗方面的应用。