[发明专利]利用双S形LEVENBERG-MARQUARDT和稳健线性回归的温度阶跃校正

说明书

本申请是申请日为2006年12月19日、申请号为200610169383.0以及发明名称为“利用双S形LEVENBERG-MARQUARDT和稳健线性回归的温度阶跃校正”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明广泛地涉及用于处理表示S形曲线或生长曲线的数据的系统和方法，并且更具体地涉及用于校正温度变化和用于确定PCR扩增曲线中的特征周期阈值(Ct)或肘值(elbow value)的系统和方法。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是一种用于酶合成或扩增限定的核酸序列的离体方法。该反应典型地利用两种寡核苷酸引物，这两种寡核苷酸引物杂交成相对股并且位于模板或要被扩增的目标DNA序列的侧面。通过热稳定DNA聚合酶来催化这些引物的延伸。包括由聚合酶引起的模板变性、引物退火和退火引物的延伸的一系列重复周期导致特定DNA片断的指数累积。荧光探针或标记典型地被用于促进扩增过程的检测和量化的方法中。

在图1中示出了典型的实时PCR曲线，其中针对典型的PCR过程画出了荧光强度值对周期数。在这种情况下，在PCR过程的每一周期中监控PCR产物的形成。通常在温度循环器中测量扩增，该温度循环器包括用于在扩增反应过程中测量荧光信号的部件和装置。这种温度循环器的例子是Roche Diagnostics LightCycler(Cat.No.20110468)。借助荧光标记的杂交探针来例如检测扩增产物，该荧光标记的杂交探针仅仅在它们被结合到目标核酸上时才发射荧光信号，或者在某些情况下也借助结合到双股DNA上的荧光染料来例如检测扩增产物。

对于典型的PCR曲线来说，识别在基线区域末端处的通常被称为肘值或周期阈值(Ct)的过渡点极其有助于理解PCR扩增方法的特征。该Ct值可被用作PCR过程的效率的量度。例如，针对要被分析的所有反应确定所规定的信号阈值，并且针对目标核酸以及针对例如标准或看家(housekeeping)基因的参考核酸确定用于达到该阈值所需的周期数(Ct)。基于针对目标核酸和参考核酸所获得的Ct值，可以确定目标分子的绝对或相对拷贝数(Gibson等人的Genome Research6：995-1001；Bieche等人的Cancer Research 59：2759-2765，1999年；WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。图1中在基线区域15的末端处的区域20中的肘值将在周期数30的区域中。

在一些PCR试验、例如HIV试验中，在PC反应过程中典型地存在退火温度变化。该温度变化引起在出现温度变化的周期数时的荧光信号的随后变化。因此，为了计算正确的Ct值，有必要校正该信号变化。出现温度变化的周期是已知的，并且如果基线是完全平坦的并且不具有峰值，则校正该温度变化将是简单的事情。不幸地，基线常常是倾斜的并且也可能在任何位置处包含信号峰值(异常数据)。如果在温度变化位置处出现峰值，则更难以校正基线曲线。

因此，期望提供用于确定曲线、例如S形曲线或生长曲线、以及尤其是PCR曲线中的肘值的系统和方法，该系统和方法克服上述的和其它的缺点。具体地，该系统和方法应以对于例如异常数据的人为因素(artifact)来说可靠且稳健的方式实施温度阶跃校正。

发明内容

本发明提供用于通过针对在PCR过程期间可能出现的温度变化对PCR数据进行校正来改进PCR扩增曲线中的Ct确定的系统和方法。

根据一个方面，具有通过Levenberg-Marquardt(LM)回归方法所确定的参数的双S形函数被用于找到在温度变化之后的区域中曲线的一部分的近似，其中出现温度变化的周期被称为“CAC”。为在温度变化之前的区域中曲线的一部分确定稳健线性近似。利用线性近似和LM方法来确定周期CAC或CAC+1的荧光强度的值，并且从表示在出现温度变化之前曲线的一部分的数据集的一部分中减去这些值的差值，以产生已校正变化的数据集。然后，该已校正变化的数据集被返回，并且可以被显示或另外被用于进一步的处理。

在本发明的第一方面中，提供一种计算机实现的、校正具有基线部分和生长部分的聚合酶链反应(PCR)生长曲线的数据集中的温度阶跃变化的方法，该方法包括：

-接收聚合酶链反应生长曲线的数据集，其中所述数据集包括动态聚合酶链反应(PCR)过程的多个数据点，每一个数据点具有一对坐标值(x，y)，其中x表示周期数，并且y表示扩增多核苷酸的累积；