[发明专利]导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及大豆根瘤菌基因工程菌株的构建方法。

背景技术

氮是构成蛋白质和核酸的主要物质，是农业生产中必不可少的生物肥料。生物固氮是指分子氮通过固氮微生物固氮酶系的催化形成氨的过程。生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质，这是地球上氮素循环的一个重要组成部分。自然界中的生物固氮有三种形式，一种是细菌的自生固氮，是指微生物自主生活，独立进行固氮；另一种是共生固氮，指土壤中的固氮菌与宿主植物形成共生固氮体系，进行生物固氮；第三种是联合固氮，它是指某些固氮细菌在高等植物根际形成的一种特殊的共生固氮作用。共生固氮在农业生产上有重要的经济价值，其中最主要的是豆科植物与根瘤菌构成的共生固氮体系。

目前，大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，对大豆植株结瘤数量的增加少，对大豆产量增幅小。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，对大豆植株结瘤数量的增加少，对大豆产量增幅小的问题，而提供导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法。

导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建方法按以下步骤进行：一、对快生型大豆根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifA，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit进行纯化，再将纯化后的目的基因nifA与TA克隆载体pMD18-T进行连接，获得连接产物；三、将连接产物转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆子的筛选与鉴定，然后采用碱裂解法提取质粒载体pUC19，再将目的基因nifA与质粒载体pUC19分别经SacI和SalI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pUC19-nifA；四、以重组载体pUC19-nifA为模板进行PCR扩增，获得P_lac-nifA片段(带有lac启动子的nifA基因片段)，然后将P_lac-nifA片段与pET-28a质粒载体分别经NcoI和SacI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pET-28a-P_lac-nifA；五、以重组载体pET-28a-P_lac-nifA为模板进行PCR扩增，获得P_lac-nifA-T7片段(带有lac启动子的nifA基因及T7终止子的片段)，然后将P_lac-nifA-T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组原核生物表达载体pTR-P_lac-nifA；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-P_lac-nifA转化到大豆土著根瘤菌中，即完成导入nifA基因的大豆根瘤菌基因工程菌株HD-SFH-01的构建；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCGTCGACTTATGACTGAATTATCC-3’，下游引物为5’-CGCGAGCTCACCGAATTTAGATCTT-3’；步骤四中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCCCATGGATTACCGCCTTTGAGT-3’，下游引物为5’-CGCGCGGCCGCTGCAAGGCGATTAA-3’；步骤五中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCGGTACCATTGTGAGCGGATAAC-3’，下游引物为5’-GCGGGTACCTAGTTCCTCCTTTCAG-3’。

nif基因主要为编码固氮酶复合物的基因，而nifA的编码产物负责调控nif基因的转录。nifA是转录的正调节基因，编码的转录活化蛋白，最先是在肺炎克氏杆菌中发现的。nifA基因的产物NifA蛋白具有ATP酶活性，是转录的正调节产物，它直接催化nif基因和fix基因的表达，因此成为生物固氮过程的核心因子。除此之外，它还参与根瘤菌的共生结瘤过程并影响根瘤的颜色、数量、分布、发育及分化等。