[发明专利]导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及大豆根瘤菌工程菌株的构建方法。

背景技术

氮是自然界中动物、植物、微生物不可缺少的生命元素，在活细胞内，氮是所有氨基酸、核酸及其他许多重要分子的主要组成部分。大气中的氮，必须通过以生物固氮为主的固氮作用，才能被植物吸收利用，动物直接或间接地以植物为食物才能吸收利用氮素。生物固氮是指某些种类的固氮微生物利用体内的固氮酶在常温常压下将大气中的氮还原成氨的过程。根据固氮微生物的固氮特点以及与植物的关系，可以将生物固氮作用分为自生固氮、共生固氮和联合固氮三类。大豆根瘤菌是共生固氮微生物中的一类，与宿主植物形成共生固氮体系后进行生物固氮，为宿主植物提供生长所必需的氮元素。统计表明，在3种固氮形式中，共生固氮效率最高，固氮量最多。长期以来，人们把豆科植物根瘤的固氮作用视为粮食生产的基础，它既可保持土壤肥力，又可提高粮食作物的产量。

生物固氮仍然是生命科学研究中的重大课题，而且在农业生产中也具有重要的应用价值。生物固氮不仅固氮量大，而且还可以提高土壤肥力，改善土壤板结情况，减少化肥的使用量，不污染环境；更为重要的是它有取之不尽，用之不竭的廉价氮源，常温常压下可以固氮，成本低，利用率高，因此，生物固氮是今后肥料发展的主要方向之一。黑龙江省是我国大豆的主产区，年播种面积、总产量和出口量均居全国首位，加强生物固氮作用的研究及应用对提高我省大豆的产量有重要意义。

目前，大豆根瘤菌工程菌株在接种到大豆幼苗后，对大豆植株结瘤数量少，根瘤菌的固氮能力差，对大豆产量增幅小。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有大豆根瘤菌工程菌株在接种到大豆幼苗后，对大豆植株结瘤数量少，根瘤菌的固氮能力差，对大豆产量增幅小的问题，而提供导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法。

导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法按以下步骤进行：一、对快生型大豆根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nodD，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit进行纯化，再将纯化后的目的基因nodD与TA克隆载体pMD 18-T进行连接，获得连接产物；三、将连接产物转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆子的筛选与鉴定，然后采用碱裂解法提取质粒载体pUC19，再进行PCR扩增，获得lac启动子，然后lac启动子和质粒载体pET-28a分别经BglⅡ和Nco I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒载体pET-P_lac；四、将目的基因nodD与重组质粒载体pET-P_lac分别经Nco I和Xho I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pET-P_lac-nodD；五、以重组载体pET-P_lac-nodD为模板进行PCR扩增，获得P_lac-nodD-T7片段，然后将P_lac-nodD-T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组原核生物表达载体pTR-P_lac-nodD；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-P_lac-nodD转化到大豆土著根瘤菌中，即完成导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物为5’CGGCCATGGGTTTTAAGGG-3’，下游引物为5’-GCGCTCGAGTTGCGGGCTCAAGGGTG-3’；步骤三中PCR扩增所用上游引物为5’CGCAGATCTAAACGCCTGGTAT-3’，下游引物为5’-GCGCCATGGCTGTTTCCTGTGTG-3’；步骤五中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3’，下游引物为5’-CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3’。