[发明专利]体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，包括脐带胎盘的机械切割，胶原酶消化，间充质干细胞的分离培养，间充质干细胞的体外扩增，其特征在于，所述间充质干细胞的体外扩增在滚瓶中进行，所用的培养体系为：所述培养体系，按体积百分比浓度包括如下成份：基础培养基占82-87％，生长因子占2％，FBS占10-15％，L-谷氨酰胺占0.99％，硫酸庆大霉素占0.01％。

2.根据权利要求1所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述基础培养基和生长因子均为MesenPRO RS^TM Medium。

3.根据权利要求2所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将检测合格的脐带胎盘经过机械切割后，经过II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种于培养瓶或培养板中；

2)获得的原代细胞待24-72小时细胞贴壁后全量更换培养液，2周后增长速度加快，成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长；

3)待细胞达到80-90％融合时，经TrypLE^TMSelect(GIBCO)传代1次，按1400-2000个细胞/cm²的密度将细胞接种至滚瓶中，在上述培养体系中体外扩增；

4)待细胞达到80-90％融合时，经胰酶消化，将单细胞悬液接种至滚瓶中，经过初期融合和细胞倍增，进行大规模的体外扩增。

4.根据权利要求3所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4)中滚瓶培养系统细胞倍增时间为24-48h。

5.根据权利要求3所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的滚瓶培养系统在细胞贴壁前使用的转数为10-15转/小时，转动2-4小时；贴壁后减少转动速度至5-10转/小时。

6.根据权利要求3所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述滚瓶的直径为275mm，高度120mm，表面积为850cm²。

7.根据权利要求3所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述滚瓶在接种细胞前不需基质的包被。