[发明专利]皱纹盘鲍精子冷冻保存方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种皱纹盘鲍精子的保存方法，尤其是一种保存期长、存活率高、运输方便的皱纹盘鲍精子冷冻保存方法。

背景技术：

皱纹盘鲍(Haliotis discushannai)的营养价值较高，被称为“软黄金”，在国际市场上每吨售价达4～6万美元，为此，皱纹盘鲍的人工繁殖或增养殖发展迅速。但是由于多年人工繁殖导致苗种质量下降，人工育苗期间稚鲍剥离后大量死亡、单位面积和总体出苗率降低，不但严重影响了养成用苗，而且养殖成鲍也会出现死亡现象。为解决苗种质量下降的问题，每年需从原产地选取雄性种鲍，采集其精子后再与养殖地雌性种鲍所产的卵子人工受精。长途运输种鲍不但占用空间大、运输成本高，而且会造成种鲍死亡，同时还存在着检疫繁琐等问题。另外从种质资源保护的角度考虑也需要建立精子库，以进行遗传学方面的研究。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种保存期长、存活率高、运输方便的皱纹盘鲍精子冷冻保存方法。

本发明的技术解决方案是：一种皱纹盘鲍精子冷冻保存方法，其特征是将按如下步骤进行：

a.用消毒的自然海水将活力90％以上的精子稀释至8×10⁸～11×10⁸个/ml，得到精子稀释液；

b.将精子稀释液与抗冻液按体积比1∶2混合并装入冷冻管中，冰箱内4℃预冷10～15min，置于液氮罐内液氮面上方8cm处15min，再浸入液氮中，所述抗冻液是将甘油、二甲基亚砜及煮沸消毒海水混合制成混合液，各组分体积百分比分别为甘油8％、二甲基亚砜10％、水82％，再向混合液中加入蔗糖及海藻糖，蔗糖的加入量为2.5g/100ml，海藻糖的加入量为0.95g/100ml。

本发明所保存的皱纹盘鲍精子保存期长、运输方便，解冻后成活率可达70％、受精率达40％，可避免长途运输种鲍所存在的占用空间大、运输成本高、种鲍死亡及检疫繁琐等问题，可用于皱纹盘鲍精子库的建立、鲍的引种和杂交，利于皱纹盘鲍的种质资源保护。

具体实施方式：

a.用消毒的自然海水(现有养殖皱纹盘鲍用海水)将活力90％以上的精子稀释至8×10⁸～11×10⁸个/ml，得到精子稀释液；

b.将精子稀释液与抗冻液按体积比1∶2混合并装入冷冻管中，冰箱内4℃预冷10～15min，置于液氮罐内液氮面上方8cm处保持15min，再浸入液氮中，所述抗冻液是将甘油、二甲基亚砜及煮沸消毒海水混合制成混合液，各组分体积百分比分别为甘油8％、二甲基亚砜10％、水82％，再向混合液中加入蔗糖(天津市科密欧化学试剂有限公司产品)及海藻糖(国药集团化学试剂有限公司产品)，蔗糖的加入量为2.5g/100ml，海藻糖的加入量为0.95g/100ml。

需要使用精子时，将冷冻管从液氮罐中取出，置于20℃水中解冻。解冻后精子成活率70％，将精子与卵子人工受精，受精率为40％。