[发明专利]一种变构酸的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种变构酸的制备方法，特别涉及一种利用脂肪酶水解变构霉素来制备变构酸的制备方法。

(二)背景技术

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是世界范围的主要病害，它可以侵染400多种双子叶植物，给许多国家造成严重的经济损失。国际上虽对油菜菌核病进行了广泛研究，但由于目前在十字花科植物中缺少抗菌核病的基因源，利用传统的育种方法对菌核病抗性的提高，是一个漫长的过程，进展相当缓慢，难以满足生产需求。此外，利用多菌灵等农药防治菌核病虽然取得一定的成效，但是也造成病原菌对药剂的抗性问题日益突出。

半知菌亚门葡萄孢属灰葡萄孢(Botrytis cinerea)分生孢子梗直或屈曲，无色，光滑，分枝，分枝末端常明显膨大，形成无色或淡色的瓶状产孢细胞。产孢细胞多芽生，分生孢子椭圆形，单孢，无色或灰色，聚集成堆成灰色，通常产生黑色不规则的微菌核。由灰葡萄孢引起的灰霉病是一种植物病害，灰葡萄孢能在生产期和收获后运输期侵染多种经济作物，包括鲜果类植物草莓、葡萄、苹果、柑橘等；蔬菜类番茄、黄瓜、甘蓝、莴苣等；观赏植物郁金香、秋海棠、天竺葵、菊花等。灰霉病的发生会引起大面积植物死亡，造成严重的经济损失。寻求对环境相容性好，对病原菌具有持久效果的农药显得格外重要。

据现有资料报道，多种以顺丁烯二酸酐结构为核心结构的天然化合物在杀菌、除草方面表现出了很强的生物活性，其中Scytalidin、Heveadride和Dihydroepiheveadride具有良好的抗真菌谱，Cornexistin和Hydroxycornexistin已经被开发为高效除草剂。Zopfiellin已在日本开发为抗灰霉病菌药物，变构霉素和变构菌素具有高效的抗菌核病菌活性。变构酸可以通过对变构霉素的碱法水解(Cheng，X.C.；Ubukata，M.；Isono，K.J.Antibiot.1990，43，809-819.)或化学合成来制备(Deshpande，A.M.；Natu，A.A.；Argade，N.P.Synthesis 2001，702-704.)，并对其抑制蛋白磷酸酶进行了研究。变构酸的现有工艺是碱水解，具有水解条件激烈、易产生副产物等缺点。

(三)发明内容

为了克服变构酸碱水解合成工艺水解条件激烈、易产生副产物等缺点，本发明提供一种工艺简单、得率高、副产物少的酶法水解变构霉素制备变构酸的新方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案如下：

一种如式(I)所示的变构酸的制备方法，所述方法包括如下步骤：将变构霉素溶解于0.1-0.5M的缓冲液A中，配制成浓度为5000-50000μg/mL的变构霉素溶液，再将脂肪酶溶解于0.1-0.5M的缓冲液B中，配制成浓度为100-500U/mL的酶液；将酶液加入到变构霉素溶液中，并且变构霉素与脂肪酶酶活力之比为500-5000μg/U，即每个肪酶酶活力单位加入500-5000μg的变构霉素，于25-40℃下反应0.5-5.0h，反应结束，将反应液的pH调至4.0，再将所述反应液用等体积的萃取溶剂A萃取，分离出萃液层和水层；取水层将pH调至2.0，本发明通常以无机酸来调pH值，水层用等体积的萃取溶剂B萃取，取有机层，用饱和盐水洗涤后再用Na₂SO₄干燥，真空蒸馏浓缩溶剂，得到变构酸粗品；将所述变构酸的粗品再以乙酸和二氯甲烷溶剂为梯度洗脱的洗脱剂，经硅胶柱进行梯度洗脱，取含变构酸的柱层析产品，将得到含变构酸的柱层析产品合并用丙酮重结晶，得到如式(I)所示的变构酸产品，

本发明所说的脂肪酶有酵母脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、诺维信脂肪酶等等。

本发明所述的缓冲液A与缓冲液B并不是两个不同的概念，而是以A和B来区别它们用于不同的反应阶段，其含意就是本领域普通技术人员所公知的“缓冲液”，所述缓冲液A与缓冲液B可以相同或不同，各自独立为下列之一：磷酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。所述缓冲液A与缓冲液B均优选为磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的浓度最优选0.2M。

本发明方法优选将酶液加入到变构霉素溶液中时，使变构霉素与脂肪酶酶活力之比为1000-4000μg/U。

所述的变构酸的制备方法，所述反应温度为35℃，反应时间为3小时。