[发明专利]一种用于止血的人凝血因子VII及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于一种新的多肽类化合物，具体涉及用于止血的人凝血因子VII及其制备方法，可用于创伤出血后的止血。

背景技术

出血是战时和平时最常见的紧急情况之一，在战伤救治中是否能有效止血对挽救伤员生命起着至关重要的作用。目前临床上常用的立芷雪(巴西矛头蝮蛇血凝酶)由于其疗效明确，在临床广泛使用，但由于该药为国外进口，我国无自主知识产权，因此出于国家战略安全考虑不可能将其作为军队特需药品使用。因此研发具有自主知识产权的止血药列装部队对减少战时由于失血引起的伤亡具有重要作用。

我国现行装配的急救包中的止血材料的功能仍属传统压迫包扎止血，这些止血材料虽对一线伤员的紧急救治起了积极的作用，但科技含量不高，功效低，远不能满足现代高技术局部战争条件下战伤急救，特别是一线救治的需要。目前临床常用的止血材料如纱布、纤维、绷带等止血时间长，易与伤口粘连而不易换药，对伤口的感染和化脓等无能为力；而一些可降解的止血材料，如明胶海绵、纤维蛋白胶及胶原海绵等，也存在着与组织黏附力较差，对有凝血功能障碍的止血望洋兴叹，且还有可能导致病毒感染的弱点；虽通过载入一些高效止血剂如：凝血酶、抑肽酶等(Tachocomb^R)可明显改善其止血性能，但除增加了生产成本外，还需要苛刻的储存条件，或者繁琐的操作过程(即用即配)。因此，高效止血剂的研制一直是各国医药工作者关注的焦点，一些经济大国更是每年耗资数亿用于该类产品的研发。

在各类止血剂中，多孔止血剂以其特有的理化性能引起人们的关注。这类止血剂的止血功能和它们的多孔结构有关，当其作用于创口时，能够利用液体特有的毛细现象，迅速吸取伤口血液中的水分，从而使血液中的凝血物质迅速聚集，凝结在伤口表面，堵塞住破裂的血管，达到止血的目的。这类止血剂主要有无机沸石类和天然可降解生物材料两大类。2002年获得美国FDA批准的由美国Z-Medica公司生产的QuikClot就是一种由多孔沸石复合材料组成的粉术状止血剂，在伊拉克战争中已装备给美军士兵。最近公开的美国专利US6060461也描述了一种具有微孔结构的颗粒材料，它的止血效果非常显著。但这类无机多孔止血剂在吸收血液中的水分后会放出大量的热，最高温度能达到100℃左右，对实验动物创面周围皮肤，肌肉，神经，血管和脂肪组织造成明显热损伤。因此未来的趋势是研制生物相容性、组织吸附性和吸湿性好的高效止血药物。

发明内容

本发明旨在提供一种从人类血液中提出分离得到的多肽类化合物，可用于创伤出血后的止血。其分离纯化方法步骤为：

1、新鲜人血浆用冷冻1周以上

2、取冷冻人血浆，加入氯化钡溶液，混合后，离心。沉淀用缓冲液清洗，将沉淀加入到硫酸铵中进行混悬，混合，离心，收集上清液，得凝血因子粗提物

3、分离出的粗提物用盐缓冲液透析以除去硫酸铵。

4、分离得到的凝血因子粗提物加到抗凝血因子VII亲和层析柱上，用缓冲液洗脱，得到凝血因子VII。

本发明具有以下特点

1.采用抗凝血因子VII亲和层析柱从人血浆中提纯分离得到了凝血因子VII。

具体实施方式

实施例1  分离纯化方法示例1

1、新鲜人血浆用枸橼酸钠抗凝后于-20℃冷冻1周以上，自然解冻，绸布过滤去除絮状物，得滤液，备用。

2、取冷冻人血浆，加入1mol/L BaCl2溶液，混合1h后，5000转/分离心15min。沉淀用0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.00)清洗3次，将沉淀加入到40％(NH4)2S04中进行混悬，在2～4℃混合18h后，5000转/分离心10min，收集上清液，得凝血因子粗提物；分离出的粗提物用0.9％NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.00)透析18h以除去(NH4)2S04。

3、分离得到的凝血因子粗提物加到抗凝血因子VII亲和层析柱上，未被吸附的蛋白用于后续分离。层析柱用平衡缓冲液充分冲洗，然后用0.5M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(pH7.00)洗脱，直至洗脱液在280nm的吸收度＜0.1。最后用2M盐酸胍(pH7.00)洗脱解吸附得到凝血因子VII。