[发明专利]检测酒精代谢相关基因突变的方法及其引物与TaqMan-MGB探针

说明书

技术领域

本发明涉及用分子生物学方法对突变碱基进行定性、定量检测的引物和探针。特别是涉及用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantificationPCR)技术对酒精代谢相关基因突变进行定性、定量检测的引物和TaqMan-MGB探针。

背景技术

饮酒会导致多种疾病，包括慢性胃炎，中毒性肝炎，心肌肥大，尿路结石，不可逆转的脑损害以及酒精中毒，精神障碍和人格改变等。饮酒的健康危害主要由酒精(乙醇)及其中间代谢产物乙醛引起，两者在体内的有效剂量水平和作用时间长短除与酒精摄入量，饮酒频率相关外，还与体内的代谢酶活性相关。

一般情况下，乙醇在人体代谢过程中主要受肝脏中的乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)和细胞色素P450(CYP2E1)所制约。乙醇在肝脏内转化成乙醛，乙醛再氧化为乙酸，分解成二氧化碳和水排出体外。

人群中发现有7种多态性的ADH(ADH1-ADH7)，其中ADH1B和ADH1C在乙醇代谢过程中有很重要的作用。

ADH1B由ADH1B基因编码产生，不同的基因型影响ADH1B的活性，从而对体内乙醛浓度产生影响。ADH1B基因存在A/G多态性。G等位基因是野生型，携带这一等位基因的人群体内ADH1B的活性相对于携带A等位基因的人群来说较低。A等位基因使ADH1B具有较高的活性，携带这一等位基因的人能迅速将吸收的乙醇催化反应形成乙醛。AA基因型的个体酶活很高，属于快代谢型，能够将乙醇很快地转化成乙醛。

ADH1C基因编码一种醇脱氢酶ADH的γ亚基。乙醇随血液循环到达肝细胞，分解代谢被激活。ADH1C基因存在一个A/G多态性，此多态性可导致其编码的二聚体ADH具有不同的活性，进而导致不同个体对酒精代谢的速度不同。其中A型等位基因的ADH1C酶活性约为G型等位基因的2.5倍。AA基因型其ADH1C酶具有很高的催化活性，属于快代谢型，能够加速体内酒精的代谢。

人体器官和组织中至少有12种不同基因编码的ALDH，常见的有ALDH1-ALDH4四种，是人体肝脏内的主要同工酶。在12种ALDH中只有ALDH2表现出遗传多态性。ALDH2位于线粒体内，而ALDH1，ALDH3，ALDH4位于胞液内。ALDH2催化酒精代谢过程中从乙醛到乙酸的代谢过程。ALDH2基因型与饮酒者对乙醇的敏感性、耐受性、酒后反应、饮酒行为、以及引发疾病密切相关。该多态性位点形成G/A多态性，可造成ALDH2氨基酸序列中的一个谷氨酸转化为赖氨酸，导致ALDH2酶活性的改变。ALDH2是四聚化合物酶，突变影响了四聚体结构的稳定性，进而会影响酶的活性，进而对乙醇代谢过程的效率造成不同的影响。A等位基因造成ALDH2酶活性的急剧下降，G等位基因则保持其正常活性

细胞色素P450家族成员CYP2E1，与药物代谢和脂类合成等功能相关。它对一些内源和外源的化学物质具有代谢功能，例如酒精、丙酮等等。CYP2E1是乙醇代谢中起主要作用的关键酶之一，它受乙醇诱导并参与乙醇的代谢。这一基因存在一个C/G多态性，该多态性位于CYP2E1的转录调节区域，C等位基因可能直接影响下游外显子的表达，从而影响CYP2E1酶的活性，使个体对酒精等物质的代谢能力发生改变。它与肝损伤、肝硬化及多种肿瘤等疾病的易感性具有关联。

通过检测ADH1B、ADH1C、ALDH2和CYP2E1这4个基因的多态性特点，可以得知相应酶代谢活性高低，判断个体酒精代谢能力和特点，从而为筛选高位敏感个体和采取预防措施以减少乙醇相关性疾病的发生提供理论基础。

目前，已报道的用于酒精代谢相关基因突变的方法主要包括PCR直接测序和定性PCR等，这些方法普遍存在灵敏度低，特异性不高，费时费力且易污染等缺点，使应用受到一定限制。