[发明专利]一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法

权利要求书

1.一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统，其特征在于，包括双路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理系统，双路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经采集信号处理系统中电压放大电路，后经数据采集卡进行信号放大、模数转换，最后输入电脑处理得到信息。

2.根据权利要求1所述双路频分复用荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述双路频分复用荧光共焦显微镜包括显微物镜(2)、三个分光棱镜、一个二向色镜组(3)、光电倍增管(4)、成像透镜(6)、CMOS摄像机(7)、两个反射镜、两个斩波器，激光光束首先通过第一反射镜(12)和第一分光棱镜(11)被分成强度相同的两束，送入两个调制频率不同的斩波器(10)分别进行调制，然后再通过第二反射镜(9)和第二分光棱镜(8)将两束光合成一束，将合成光束通过第三分光棱镜(3)，得到两束激发光照射到位于显微物镜(2)焦平面上的生物样品(1)上，生物样品(1)产生两束荧光随后反向通过显微物镜(2)聚光，再次通过二向色镜组(3)，进入第三分光棱镜(5)，分为强度相同的两束，其中一束通过消色差成像透镜(6)，聚焦后进入位于透镜(6)的焦平面位置上的CMOS摄像机(7)，另一束则进入光电倍增管(4)。

3.一种双路频分复用荧光共焦显微成像实现方法，包括双路频分复用荧光共焦显微成像系统，其特征在于，方法具体包括如下步骤：

1)将准直半导体激光器发出的紫色405nm激光光束通过扩束镜扩束形成直径为10mm的平行光束，再通过第一分光棱镜(11)，把光束分为两束等强度光束，其中一束为透射光，另外一束经过第一反射镜(12)反射，调节第一反射镜(12)的位置，使反射光与透射光束平行；

2)在这两束光传播过程中，引入双通道光斩波器(10)，每个通道分别用不同的斩波频率调制斩波，然后继续将其中一束使用第二反射镜(9)将光束转折90°传播，两束光从两个垂直方向同时通过第二分光棱镜(8)合光得到重合的一束激光；

3)从第二分光棱镜(8)中出射的一束光进入二向色镜组(3)中，二向色镜组(3)由二向色镜、荧光滤色片和激发光滤色片组成，能分别使激光器发出的405nm激光和荧光，单方向从二向色镜出射，将被调频的双路激发激光通过40倍的无限远显微物镜(2)聚焦后照射在样品(1)上，产生双点激发荧光信号，两点间距离通过调节反射镜(9)实现，将生物样品(1)固定在三维调节架的平台上，通过调整三维调节架调整样品与显微物镜的距离，使样品(1)恰好处于光焦点所在位置并且保持显微物镜(2)与样品(1)的垂直关系；

4)从样品(1)中发出的双点荧光信号具有同各自的激发激光束相同的频率，再通过二向色镜组(3)将发射回来的激发激光过滤后，出射的荧光信号进入第三分光棱镜(5)，其中一束荧光耦合入消色差成像透镜(6)后进入位于透镜焦点处的彩色CMOS摄像头(7)；另一束荧光进入光电倍增管(4)，然后接入电压放大电路，通过数据采集卡将采得的信号送入计算机中进行采集和处理；

5)信号处理的步骤是首先对采集信号进行傅立叶变换，得到频谱信息，然后进行选频滤波，根据调制信号频率将两束荧光信号的频谱信息挑选出来，然后再进行傅立叶逆变换得到解调的双路荧光随时间变化信息。

4.根据权利要求3所述双路频分复用荧光共焦显微成像实现方法，其特征在于，所述步骤2)中两个斩波通道分别设定一定的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍，即载波频率ω₁和ω₂需要满足：ω₁-ω₂≥2ω_H，其中ω_H是最高荧光信号变化频率，以确保两路信号不发生相互串扰。