[发明专利]流感病毒M2e蛋白的制备及其在抗甲型流感病毒中的应用

说明书

发明领域

本发明涉及融合蛋白质及其制备，特别是涉及人血清白蛋白(HSA)与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白，及其制备方法和在抗甲型流感病毒研究中的应用。

发明背景

M2蛋白是流感病毒主要的膜蛋白之一。自从1933年分离到第一株人甲型流感病毒株A/WS/33(H1N1)以来，尽管经历了几次世界性大流行，M2蛋白胞外区(Extracellular domainof M2 protein，M2e)都未发现存在明显差异。研究发现，针对M2蛋白胞外功能区的单克隆抗体，具有在细胞培养中抑制流感病毒复制的功能。更重要的是，M2e蛋白诱生的抗体能够产生保护性免疫。由于目前在人群中流行的所有甲型流感病毒，其M2蛋白的胞外区M2e都没有发现存在明显差异，认为M2e在流感病毒株间是高度保守的。因此，M2e蛋白被认为是可刺激机体对不同流感变异株都能产生具有交叉保护效果的保护性抗原。

人血清白蛋白是人血浆中最丰富的蛋白，占血浆总蛋白的60％左右。除了在血浆中含有HSA外，在组织、皮肤、淋巴腔和身体的分泌液中也含有HSA。HSA也是血液中重要的功能蛋白，具有维持血液胶体渗透压，结合和运输内源性及外源性物质，清除自由基，抗凝血及影响动脉血管的渗透性等生理功能。

人血清白蛋白是由585个氨基酸残基组成的单链非糖基化的球形蛋白。同时，HSA是一种惰性蛋白，在体内较稳定，其本身即为许多内源因子和外源药物的载体。HSA的结构显示，其N端和C端处于蛋白上相反的突出部位，无论N端或C端的融合都不必在cDNA中间插入连接序列，非常适于进行蛋白融合，药物和HSA结合后，可以减少其生物利用度，增加在体内的半衰期，从而可以提高疗效。由此产生了人血清白蛋白融合技术，目前此技术已经被广泛应用。同时，HSA在毕赤酵母中可以高效分泌表达，且上清杂蛋白含量较少，纯化比较方便，更容易实现大规模生产。

本发明首次制备并提供了一种由人血清白蛋白(HSA)与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白，及其制备方法和在抗甲型流感病毒研究中的应用。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种由人血清白蛋白与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白。

在本发明的融合蛋白中，M2e蛋白位于人血清白蛋白融合蛋白的C-端。

根据本发明的优选实施方案，所说的融合蛋白是以DNA重组技术产生的。

根据本发明的优选实施方案，其中所使用的重组表达系统是酵母表达系统，可以将编码本发明融合蛋白的核苷酸序列克隆至酵母表达载体中。本发明优选的巴斯德毕赤酵母表达系统可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的，最优选的是毕赤酵母X-33。

本发明所形成的融合蛋白既保留了人血清白蛋白的活性，又保留了M2e蛋白的活性。用甲型流感病毒H1N1和H3N2对小鼠滴鼻进行攻击，融合蛋白HSA/M2e能显著地减少小鼠体重的丢失和降低小鼠的死亡率，并降低肺部病毒滴度，保护小鼠抵抗甲型流感病毒的攻击。

可以使用本领域熟知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法等方法获得编码人血清白蛋白的多聚核苷酸和编码流感病毒M2e的多聚核苷酸。用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等，也可以用人工合成的方法获得。人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，借以提高产物的表达效率。通过PCR的方法，在保持各自阅读框不变的前提下，在编码序列的两侧引入适当的限制性内切酶位点，通过酶切产生粘性末端，并在DNA连接酶作用下，实现编码人血清白蛋白和编码流感病毒M2e的多聚核苷酸的粘性末端连接，得到编码本发明融合蛋白的基因。所用标准的分子克隆方法参见J.萨姆布鲁克等《分子克隆试验指南》第三版，科学出版社，2002。

得到携带融合蛋白基因的重组表达载体后，可使用通常的方法，如锂盐法、PEG法和电穿孔法等方法转化宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法。可通过人们熟知的技术加以鉴定，如收集并裂解细胞，提取DNA，然后用PCR方法鉴定被成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞。或者，可用抗人血清白蛋白或流感病毒M2e蛋白的抗体检测细胞培养上清中的蛋白。

可以使用摇瓶或生物反应器，培养含有本发明DNA构建体的宿主细胞，以生产本发明的融合蛋白。所使用的培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，包含氮源、碳源、pH调节成分等，培养基配方应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分为两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)生长，第二阶段主要用于产物的合成。